Pestisidler global azyk ýetmezçiligini çözmekde we wektorlardan geçýän adam kesellerine garşy göreşmekde möhüm rol oýnaýar. Şeýle-de bolsa, pestisidlere garşy göreşmek meselesiniň artmagy, ulanylmadyk nyşanalary nyşana alýan täze birleşmeleriň açylmagyny gyssagly talap edýär. Mör-möjekleriň geçiş reseptor potensialy (TRPV) kanallary — Nanzhong (Nan) we işjeň däl (Iav) — geterologik kanallary (Nan-Iav) döredip, mör-möjeklerde geotropizmi, eşidişi we propriosepsiýasyny amala aşyrýan mehanosensor organlara ýerleşip biler. Käbir pestisidler, mysal üçin, afidopirrolidon (AP), näbelli mehanizmler arkaly Nan-Iav-y nyşana alýar. AP deşýän sorujy mör-möjeklere (hemipterans) garşy täsirli bolup, filamentleriň funksiýasyny bozmak arkaly iýmitlenmegiň öňüni alýar. AP diňe Nan bilen baglanyp biler, ýöne diňe Nan-Iav endogen nikotinamid (NAM) ýaly agonistler bilen özara täsirleşip, kanal işjeňligini görkezip biler. Nan-Iav-yň insektisid nyşany hökmünde mümkinçiligine garamazdan, onuň kanal ýygnanmasy, düzgünleşdiriji baglanyş ýerleri we Ca2+-garaşly düzgünleşdirilişi barada az zat mälim, bu bolsa insektisidleriň mundan beýläk ösmegine päsgel berýär. Bu gözlegde, Hemiptera mör-möjeklerinde Nan-Iav-yň gurluşyny kalmodulin-ligandsyz ýagdaýda, şeýle hem ankirin gaýtalanýan sitoplazmatik domeniniň (ARD) serhedinde AP we NAM bilen kesgitlemek üçin krio-elektron mikroskopiýasy ulanyldy. Geň galdyryjy zat, Nan belogynyň özüniň AP arkaly amala aşyrylýan ARD özara täsirleri bilen durnuklaşdyrylýan pentamer emele getirip bilýändigini anykladyk. Bu gözleg insektisidler we agonistler bilen Nan-Iav arasyndaky molekulýar özara täsirleri açyp görkezýär, kanal funksiýasynda we ýygnanyşynda ARD-iň ähmiýetini görkezýär we Ca2+ düzgünleşdiriş mehanizmini öwrenýär.
Dünýäde howanyň barha güýçli üýtgemeginiň fonunda, global azyk howpsuzlygynyň ýaramazlaşmagy 21-nji asyryň esasy kynçylyklarynyň biri bolup, jemgyýet üçin dürli netijeleri berýär.1,2Bütindünýä Saglygy Goraýyş Guramasynyň 2023-nji ýyl üçin Dünýäde Azyk Howpsuzlygynyň we Iýmitlenmegiň Ýagdaýy (SOFI) hasabatynda dünýäde takmynan 2,33 milliard adamyň ortaça we agyr derejede azyk howpsuzlygynyň ýetmezçiliginden ejir çekýändigi, bu bolsa uzak wagtlap dowam edýän mesele diýlip çaklanylýar.3,4Gynansak-da, her ýyl ekin hasylynyň takmynan 20% -den 30% -e çenli ýa-da ondan hem köpüsi zyýankeşler we kesel döredijiler tarapyndan ýitirilýär we global ýylylygyň zyýankeşlere garşy durnuklylygy we ekinleriň gowşaklygyny has-da güýçlendirmegine garaşylýar.4,5,6,7,8Pestisidleriň işlenip düzülmegi diňe ekinleri zyýankeşlerden goramak we wektor arkaly geçýän kesel döredijileriň ýaýramagyny azaltmak üçin däl, eýsem pestisidlere barha çydamly bolýan dengue gyzdyrmasy, bezgek we Şagas keseli ýaly wektor arkaly geçýän adam kesellerine garşy göreşmek üçin hem möhümdir.5,9,10,11
Neýrotoksik insektisidleriň esasy nyşanlarynyň arasynda, geterotetramerik TRPV kanaly Nanchung (Nan)-Iaktiw (Iav) diňe soňky onýyllykda açylan insektisid nyşanlarynyň synpyny görkezýär, şol sanda imidakloprid we piraklostrobin ýaly täjirçilik taýdan elýeterli insektisidler hem bar.12,13,14Ýarym sintetiki insektisid aphidopirrolifen (AP) ýakynda işlenip düzülen we söwda taýdan satuwa çykarylan önüm bolup, onuň esasy komponenti AP-ni subnanomolýar işjeňlik derejesinde baglanyşdyrýan işjeň insektisid Inscalis®-dir.15AP tozanlandyryjylara, peýdaly mör-möjeklere we beýleki maksatly däl organizmlere pes derejede ýiti zäherlilik görkezýär we etiketkadaky görkezmelere laýyklykda ulanylanda, beýleki insektisidlere garşylyk basyşyny azaldyp biler.16,17,18Nan we Iav mör-möjek görnüşleriniň arasynda giňden ýaýran, diňe antennalaryň we aýaklaryň hordal uzalýan reseptor neýronlarynda bilelikde beýan edilýär we eşidiş, grawitasiýa duýgusy we propriosepsiýa üçin möhümdir.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprid we piraklostrobin Nan-Iav toplumyny özboluşly mehanizm arkaly höweslendirýär we netijede proprioseptiw signallaryň geçirilmeginiň öňüni alýar.13,16,23Bitler we ak çybynlar ýaly deşip sorýan mör-möjeklerde (gemipteranlar) propriosepsiýanyň ýitmegi olaryň iýmitlenmek ukybyna täsir edýär we ahyrsoňy ölüme getirýär.13,24Gyzykly tarapy, AP Nan-Iav toplumyna ýokary ýakynlyk, diňe Nana bolsa pes ýakynlyk görkezýär. AP-niň Nan-Iav bilen baglanyşmagy elektrik toguny döredýär, ýöne diňe Nana baglanyşmak kanal işjeňligini höweslendirmeýär. Iav özi AP bilen asla baglanyşmaýar.16Bu Nan we Iav-yň dürli Nan-Iav kanal toplumlaryny emele getirmek üçin baglanyp biljekdigini (meselem, dürli stehiometrik gatnaşyklar bilen ýa-da şol bir stehiometrik gatnaşykda dürli tertipler bilen) ýa-da AP-nyň birnäçe ýere baglanyp biljekdigini görkezýär. Mundan başga-da, tebigy agonist nikotinamid (NAM) Drosophila Nan-Iav-a mikromolýar ýakynlyk bilen baglanyp, in vitro şertlerinde bitleriň (AP) täsirlerine meňzeş täsirleri görkezýär.16,25we bitleriň köpelmegine we iýmitlenmegine päsgel berýär, netijede olaryň ölümine getirýär25,26Bu maglumatlar köp soraglary döredýär. Mysal üçin, Nan-Iav geterodimeriniň nähili emele gelýändigi, kiçi molekulalary modulirlemek üçin haýsy baglanyşyk ýerleri ulanylýandygy we bu kiçi molekulalaryň propriosepsiýany basyp ýatyrmak arkaly kanal funksiýasyny nähili düzgünleşdirýändigi belli däl. Mundan başga-da, Nan-Iav geterodimeriniň işjeň bolup, AP-e has ýokary gatnaşyk bilen baglanyşmagynyň sebäpleri belli däl. Ahyrsoňy, Nan-Iav funksiýasynyň Ca2+-garaşly düzgünleşdirilişi we onuň neýron signallaşdyrma proseslerine nähili goşulýandygy barada az zat mälim.. 13,21
Bu gözlegde, krio-elektron mikroskopiýasyny, elektrofiziologiýany we radioligand baglanyşyk usullaryny birleşdirip, biz Nan-Iav-yň ýygnanmagyny we onuň kiçi molekulaly düzgünleşdirijilere baglanmagynyň mehanizmini düşündirdik. Mundan başga-da, biz Iav we AP-durnuklaşdyrylan Nan pentamerlerine konstitutiw baglanyşykly kalmodulini (CaM) anykladyk. Bu netijeler kanallardaky kalsiý ionlarynyň düzgünleşdirilmegi, kanallaryň ýygnanmagy we ligand baglanyşyk gatnaşygyny kesgitleýän faktorlar barada möhüm düşünje berýär. Has möhümi, biz ARD-iň bu proseslerde esasy rol oýnaýandygyny tassykladyk. Degişli oba hojalyk pestisidlerine baglanýan doly mör-möjek kanallaryny öwrenmek.27, 28, 29pestisid senagatyny ösdürmek üçin mümkinçilikleri açýar, pestisidleriň netijeliligini we aýratynlygyny ýokarlandyrýar, şeýle hem global azyk howpsuzlygy we wektorlar arkaly geçýän keselleriň ýaýramagy meselesini çözmek üçin TRPV maksatly birleşmeleri beýleki görnüşlere ulanmaga mümkinçilik berýär.
Şeýle hem, Nan-Iav-yň Ca2+ tarapyndan düzgünleşdirilýändigini we düzgünleşdiriş mehanizminiň konstitutiw taýdan baglanyşykly CaM arkaly amala aşyrylýandygyny anykladyk. Iň esasysy, Nav-yň CaM tarapyndan bu Ca2+-garaşly düzgünleşdirilmegi beýleki ion kanallarynyň (meselem, naprýaženiýe bilen dolandyrylýan Na+ kanallary we TRPV5/6 kanallary) düzgünleşdiriş mehanizmlerinden düýpli tapawutlanýar.52,53,54,55,56,57Nav1.2 kanalynda CaM-iň C-terminal domeni C-terminal domeni (CTD) bilen spiral görnüşinde birleşýär we Ca2+ öz N-terminal domeniniň CTD-niň distal bölegine baglanmagyna sebäp bolýar.56TRPV5/6 kanalynda CaM-iň C-terminal domeni CTH bilen baglanyşýar we Ca2+ öz N-terminal domeniniň gözeneklere ýokary uzaldylmagyny döredýär we şeýdip kation geçirijiligini blokirleýär.53,54Biz Nan-Iav-CaM-iň Ca2+-regulýasiýa edilýän funksiýasy üçin model teklip edýäris (4h surat). Bu modelde CaM-iň N-terminal domeni Iav-iň C-terminal domenine (CTH) konstitutiw taýdan baglanýar. Dynç alyş ýagdaýynda (pes [Ca2+] konsentrasiýasy), CaM-iň C-terminal domeni Nan bilen özara täsirleşýär, ARD konformasiýasyny durnuklaşdyrýar we şeýdip kanalyň açylmagyna ýardam edýär. Agonistiň/insektisidiň kanala baglanmagy gözenekleriň açylmagyna sebäp bolýar we Ca2+ akymyna getirýär. Soňra Ca2+ CaM-e baglanýar we Nan-iň ARD-den C-terminal domeniniň dissosasiýasyna sebäp bolýar. CaM baglanyşyny blokirlemek Ca2+-iň tormozlaýjy täsirini esasan ýok edýändigi sebäpli, bu dissosasiýa ARD hereketliligini modullaşdyrýar we şeýdip Ca2+-garaşly tormozlama ýa-da desensibilizasiýa sebäp bolýar. Kalsiý ionlarynyň elýusiýasyndan soň kanal akymlarynyň çalt dikeldilmegi (4g surat) bu mehanizmiň Ca2+ arkaly neýron signallaryna çalt jogap bermegi ýeňilleşdirýändigini görkezýär. Mundan başga-da, henizem az öwrenilen Iaw-yň C-terminal sebitiniň kanal nyşanasynda we häzirki düzgünleşdirişde başga rol oýnaýandygy habar berildi.21
Ahyrsoňy, biziň gözlegimiz oba hojalyk ähmiýetli insektisid-insektisid TRP kanal toplumynyň ýokary çözgütli gurluşyny görkezýär - bu bize öň belli bolmadyk açyş. Belli bir zat, biz mör-möjek kanalynyň gurluşyny we işini mör-möjek öýjüklerinde däl-de, adam öýjüklerinde (HEK293S GnTi–) häsiýetlendirdik. Insektisidlere garşylygyň artmagy we azyk howpsuzlygyna we patogenlere dowam edýän basyşa garamazdan, biziň işimiz adam saglygy we global azyk howpsuzlygy üçin täze insektisidleriň işlenip düzülmegine ýardam berjek möhüm maglumatlary berýär. Gözlegler AP ýaly insektisidleriň etiketkadaky görkezmelere laýyklykda ulanylanda käbir zyýankeşlere garşy netijelidigini we peýdaly tozanlandyryjylara pes toksiklik berýändigini, bu bolsa olaryň ekologiýa howpsuzlygyny görkezýär.13,16Mundan başga-da, käbir AP türewleriniň çybynlarda synag edilmegi olaryň uçmak ukybyny ahyrsoňy ýitirýändigini görkezdi. Bu modulirleýji birleşmeleriň Nan-Iav bilen nähili baglanýandygyny düşünmek, bar bolan birleşmeleriň üýtgedilmegine ýa-da has netijeli we täze birleşmeleriň işlenip düzülmegine ýardam eder.takykzyýankeşlere garşy göreş. Biziň gözlegimiz Nan-Iav ARD interfeýsiniň diňe bir endogen birleşmeleriň, pestisidleriň we Ca2+-CaM-iň işjeňligini düzgünleşdirmek üçin däl, eýsem kanallaryň ýygnalmagy üçin hem möhümdigini görkezýär. Kiçi molekulalar bilen geterodimerleriň ýygnalmagyny bozmagyň ion kanallarynyň ingibitorlaryny işläp düzmek üçin özboluşly we geljegi uly çemeleşme bolup biljekdigini çaklaýarys.
Sekiz ortologik geniň içinden goňur tomjagyň (Halyomorpha halys) doly uzynlykdaky genleri saýlanyp alyndy, olar ýuwujy serişdelerde ajaýyp durnuklylyk görkezdiler. Sintezlenen genler adam ekspresiýasy üçin kodon boýunça optimizirlendi we XhoI we EcoRI çäklendirme merkezlerini ulanyp, pBacMam pCMV-DEST wektoryna (Life Technologies) klonlaşdyryldy. Bu klonlaryň HRC-3C proteazasy (PPX) tarapyndan bölünýän C-terminal GFP-FLAG-10xHis we mCherry-FLAG-10xHis tegleri bilen çarçuwada bolmagyny üpjün etdi we garaşsyzlyga mümkinçilik berdi.beýanNanchung we Inactive-i pBacMam wektoryna klonlamak üçin ulanylan praýmerler aşakdaky ýalydy:
Aýry-aýry bölejikleriň mikroskopiki suratlary K3 kamerasy we Gatan BioQuantum energiýa süzgüji bilen enjamlaşdyrylan Titan Krios G2 geçiriji elektron mikroskopynda (FEI) alyndy. Mikroskop 300 keV-de işledildi, energiýa sazlamasy 20 eV, nusga piksel ölçegi 1.08 Å/piksel (nominal ulaltma 81,000x) we defokus gradienti -0.8-den -2.2 μm-e çenli boldy. Wideo ýazgy nominal doza tizligi 25 e–px−1 s−1, ekspozisiýa wagty 2.4 s we umumy dozasy takmynan 60 e–Å−2 bolan Latitude S mikroskopy (Gatan) arkaly sekuntda 40 kadr tizlikde ýerine ýetirildi.
Şöhle bilen döredilen hereket düzedişi we doza agramy RELION 4.061-de MotionCor2 ulanyp, plýonkada ýerine ýetirildi. Kontrast geçirijilik funksiýasynyň (CTF) parametrleriniň bahalandyrylmagy kriosparkda ýama esasly CTF bahalandyryş usuly arkaly ýerine ýetirildi62. CTF laýyklyk çözgüdi ≥4 Å bolan fotomikrograflar soňraky analizden çykaryldy. Adatça, kriosparkda nokat saýlamak üçin 500–1000 fotomikrografyň bir bölegi ulanyldy, soňra şablon esasly bölejikleri saýlamak üçin aýdyň salgylanma şekilini almak üçin süzgüçden soň 2D klassifikasiýasynyň birnäçe tapgyry geçirildi. Soňra bölejikler 64 pikselli çäklendirme gutulary we 4 gezek binning ulanylyp çykaryldy. Islenilmeýän bölejik kategoriýalaryny aýyrmak üçin 2D klassifikasiýasynyň birnäçe tapgyry ýerine ýetirildi. Ilkinji 3D model ab initio rekonstruksiýasy arkaly täzeden guruldy we kriosparkda deň däl arassalamak arkaly kämilleşdirildi. 3D klassifikasiýa kriosparkda ýa-da RELIONda ARD heterojenligine esaslanyp ýerine ýetirildi. Membran domenleriniň möhüm heterojenligi syn edilmedi. Bölejikler C1 we C2 usullary arkaly arassalanyldy; ýokary C2 çözgüdi bolan bölejikler C2-ä görä simmetrik hasaplandy we Baýes arassalanmasy üçin RELION-a import edildi. Soňra bölejikler soňky deň däl we ýerli arassalanmasy üçin krioSPARC-a gaýtaryldy. Soňky çözgüdi we bölejikleriň sany 1-nji tablisada görkezilen.
Nan+AP pentamerlerini işläp bejerýänimizde, membrana domenleriniň (esasanam gözenek sebitiniň) çözgüdini gowulandyrmak üçin signaly aýyrmak we TMD maskalamak ýaly dürli usullary öwrendik. Şeýle-de bolsa, gözenek sebitindäki mümkin bolan ekstremal bozulma we TMD-niň umumy heterojenligi sebäpli bu synanyşyklar şowsuz boldy. Soňky çözgüt, esasan ARD sebitini nyşana alyp, krioSPARC-da deň däl işleme usuly bilen awtomatiki usulda döredilen maskany ulanmak arkaly hasaplanyldy. Bu membrana domenleriniň (esasanam VSLD sebitiniň) çözgüdinden has ýokary çözgüt gazandy.
Nanchung we Inactive buglaryň apo görnüşleriniň ilkinji de novo modelleri ilki Coot63 ulanylyp döredildi, Nan we Iav buglarynyň modelleri bolsa pes ynamly sebitleri kesgitlemek üçin AlphaFold264 ulanylyp döredildi. Kalmodulin modelleşdirmesi degişlilikde PDB 4JPZ56 we 1CFD65 nusgalaryndaky Ca2+-baglanyşykly we Ca2+-siz modelleriň berk jisimlere gabat gelmegine esaslandy. Modeller dogry stereohimiýa we gowy geometriýa üpjün etmek üçin sferiki kämilleşdirme arkaly kämilleşdirildi. Soňra fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin we fosfatidilserin anyk kesgitlenen lipid dykyzlyklary hökmünde modelleşdirildi we NAM we AP ligandlary berk birikmelerde degişli dykyzlyklara ýerleşdirildi. Çäklendirme faýllary PHENIX66-daky eLBOW ulanylyp izoformlaryň SMILES setirinden döredildi. Ahyrsoňy, modeller PHENIX-de hakyky giňişlikde ýerli tor gözlegini we ikinji derejeli gurluş çäklendirmeleri bilen global minimalizasiýany ulanyp kämilleşdirildi. Modeli kämilleşdirmek we gurluş seljermesi üçin MolProbity serweri ulanyldy we suratlar PyMOL we UCSF Chimera X ulanylyp ýerine ýetirildi. 67,68,69 Diafragma seljermesi HOLE serweri arkaly ýerine ýetirildi,70 we yzygiderliligi gorap saklamak kartalaşdyrmasy Consurf serweri arkaly ýerine ýetirildi.71
Statistik seljerme Igor Pro 6.2, Excel Office 365 we GraphPad Prism 7.0 ulanyp geçirildi. Ähli mukdary maglumatlar ortaça ± standart ýalňyşlyk (SEM) hökmünde görkezilýär. Iki topary deňeşdirmek üçin Studentiň t-testi (iki taraply, jübütsiz) ulanyldy. Birnäçe topary deňeşdirmek üçin bir taraply dispersiýa analizi (ANOVA) we soňra Dunnettiň post-hoc testi ulanyldy. *P< 0.05, **P< 0.01 we ***PMaglumatlaryň paýlanyşyna baglylykda < 0.001 statistik taýdan ähmiýetli hasaplandy. Kd, Ki gymmatlyklary we olaryň assimetrik 95% ynam aralyklary GraphPad Prism 10 ulanyp hasaplanyldy.
Okuw usulyýeti barada has giňişleýin maglumat almak üçin, şu makalada görkezilen Tebigy portfel hasabatynyň gysgaça mazmunyna serediň.
Ilkinji model PDB 4JPZ we 1CFD maglumat bazalaryndan kalmodulin modellerini ulanyp guruldy. Koordinatlar Belok Maglumat Bankyna (PDB) 9NVN (ligandsyz Nan-Iav-CaM), 9NVO (nikotinamide bagly Nan-Iav-CaM), 9NVP (nikotinamide we EDTA bagly Nan-Iav-CaM), 9NVQ (afenidolpirrolline we kalsiýe bagly Nan-Iav-CaM), 9NVR (afenidolpirrolline we EDTA bagly Nan-Iav-CaM) we 9NVS (afenidolpirrolline bagly Nan pentamer) giriş belgileri bilen goýuldy. Degişli krio-elektron mikroskopiýa suratlary Elektron Mikroskopiýa Maglumat Bazasyna (EMDB) aşakdaky giriş belgileri bilen ýerleşdirilýär: EMD-49844 (ligandsyz Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (nikotinamidli Nan-Iav-CaM toplumy), EMD-49846 (nikotinamid we EDTA bilen Nan-Iav-CaM toplumy), EMD-49847 (afidopirrolin we kalsiý bilen Nan-Iav-CaM toplumy), EMD-49848 (afidopirrolin we EDTA bilen Nan-Iav-CaM toplumy) we EMD-49849 (afidopirrolinli Nan pentamer toplumy). Funksional seljerme üçin çig maglumatlar bu makalada görkezilýär.
Ýerleşdirilen wagty: 2026-njy ýylyň 28-nji ýanwary