Antihelmintik derman N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE-ni (asetilholinesteraza) basyp ýatyrýandygy we aşa köp damarlaşma sebäpli potensial kanserogen häsiýetlere eýedigi habar berildi. Bu makalada biz DEET-iň angiogenezi höweslendirýän endotelial öýjükleri aýratyn höweslendirýändigini we şeýdip şişiň ösüşini artdyrýandygyny görkezýäris. DEET angiogeneze getirýän öýjük proseslerini, şol sanda proliferasiýany, migrasiýany we ýapyşmany işjeňleşdirýär. Bu endotelial öýjüklerde NO önümçiliginiň we VEGF ekspresiýasynyň artmagy bilen baglanyşyklydyr. M3-iň öçürilmegi ýa-da farmakologiki M3 ingibitorlaryny ulanmak bu täsirleriň hemmesini ýok edýär, bu bolsa DEET-iň döredýän angiogeneziniň M3-e duýgurdygyny görkezýär. M3 reseptorlaryny aşa köp ekspresirleýän endotelial we HEK öýjüklerinde kalsiý signallaşdyrmasyny öz içine alýan tejribeler, şeýle hem baglanyş we dok barlaglary DEET-iň M3 reseptorlarynyň allosteriki modulýatory hökmünde hereket edýändigini görkezýär. Mundan başga-da, DEET AChE-ni basyp ýatyrýar, şeýdip asetilholiniň bioelýeterliligini we onuň M3 reseptorlaryna baglanyşyny ýokarlandyrýar we allosteriki düzgünleşdirme arkaly proangiogen täsirleri güýçlendirýär.
Ilkinji EK-ler Şweýsariýa syçanlarynyň aortasyndan bölünip alyndy. Ekstraksiya usuly Kobayashi protokolyndan 26 alyndy. Syçan EK-leri dördünji geçelgä çenli 5% ýylylyk bilen inaktiwleşdirilen FBS goşulan EBM-2 gurşawynda ösdürilip ýetişdirildi.
DEET-iň iki konsentrasiýasynyň HUVEC, U87MG ýa-da BF16F10-yň köpelmegine täsiri CyQUANT öýjük köpelme synag toplumy (Molecular Probes, C7026) arkaly seljerildi. Gysgaça aýdylanda, her guýuda 5.103 öýjük 96 guýuly plastinkada ekildi, bir gije ýapyşdyryldy we soňra 24 sagatlap DEET bilen işlenildi. Ösüş gurşawy aýrylandan soň, mikroplastinanyň her guýusyna boýag birleşdiriji erginini goşuň we öýjükleri 37 °C-de 30 minutlap inkubasiýa ediň. Fluoresensiýa derejeleri 485 nm oýarma süzgüçleri we 530 nm emissiýa süzgüçleri bilen enjamlaşdyrylan Mithras LB940 köpmodly mikroplastinka okaýjysy (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germaniýa) arkaly kesgitlenildi.
HUVEC her bir guýuda 104 öýjük dykyzlygynda 96 guýulyk plastinkalara ekildi. Öýjükler 24 sagatlap DEET bilen işlenildi. Öýjükleriň ýaşaýyş ukyby kolorimetrik MTT synagy (Sigma-Aldrich, M5655) arkaly bahalandyryldy. Optiki dykyzlyk gymmatlyklary köpmodly mikroplastinka okaýjyda (Mithras LB940) 570 nm tolkun uzynlygynda alyndy.
DEET-iň täsirleri in vitro angiogenez synaglary arkaly öwrenildi. 10-8 M ýa-da 10-5 M DEET bilen bejergi HUVEC-lerde kapillýar uzynlygynyň emele gelmegini artdyrdy (1a, b surat, ak zolaklar). Gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, 10-14-den 10-5 M-e çenli DEET konsentrasiýalary bilen bejergi kapillýar uzynlygynyň 10-8 M DEET-de plato derejesine ýetendigini görkezdi (Goşmaça surat S2). DEET bilen bejerilen HUVEC-leriň in vitro proangiogen täsirinde 10-8 M we 10-5 M konsentrasiýa aralygynda düýpli tapawut tapylmady.
DEET-iň neowaskulýarizasiýa täsirini kesgitlemek üçin biz in vivo neowaskulýarizasiýa barlaglaryny geçirdik. 14 günden soň, 10-8 M ýa-da 10-5 M DEET bilen öňünden ösdürilen endotelial öýjükler bilen inýeksiýa edilen syçanlarda gemoglobiniň mukdarynyň ep-esli ýokarlanmagy görkezildi (1c-nji surat, ak zolaklar).
Mundan başga-da, DEET bilen induksiýa edilen neowaskulýarizasiýa U87MG ksenograft göterýän syçanlarda öwrenildi, olara her gün (ip) DEET inýeksiýa edildi, bu bolsa täsirlenen adamlarda kadaly bolan 10-5 M plazma konsentrasiýasyny döredýändigi belli bolan dozada (ip) inýeksiýa edildi. 23-de. Syçanlara U87MG öýjüklerini inýeksiýa edenden 14 gün soň anyklanyp bilinýän şişler (ýagny >100 mm3 şişler) syn edildi. 28-nji günde, gözegçilik syçanlaryna garanyňda, DEET bilen bejerilen syçanlarda şişiň ösüşi ep-esli artdy (1d surat, kwadratlar). Mundan başga-da, şişleriň CD31 boýaglary DEET-iň kapillýar meýdanyny ep-esli artdyrandygyny, ýöne mikrodamar dykyzlygyny däldigini görkezdi (1e-g surat).
Muskarin reseptorlarynyň DETA bilen induksiýa edilen proliferasiýadaky roluny kesgitlemek üçin, pFHHSiD-niň (10-7 M, selektiw M3 reseptor antagonisti) gatnaşmagynda 10-8 M ýa-da 10-5 M DETA ulanyldy. HUVEC bilen bejermek. pFHHSiD ähli konsentrasiýalarda DETA-nyň proliferasiýa häsiýetlerini doly blokirledi (1-nji tablisa).
Şeýle şertlerde, biz DEET-iň HUVEC öýjüklerinde kapillýarlaryň uzynlygyny artdyryp-artdyrmajakdygyny hem barladyk. Şeýle hem, pFHHSiD DEET-iň döredýän kapillýarlaryň uzynlygynyň öňüni ep-esli aldy (1a, b surat, çal reňkli zolaklar). Mundan başga-da, şuňa meňzeş tejribeler M3 siRNA bilen geçirildi. Gözegçilik siRNA kapillýarlaryň emele gelmegini höweslendirmekde netijeli bolmasa-da, M3 muskarin reseptorynyň susdurylmagy DEET-iň kapillýarlaryň uzynlygyny artdyrmak ukybyny ýok etdi (1a, b surat, gara zolaklar).
Mundan başga-da, 10-8 M ýa-da 10-5 M DEET arkaly in vitro damarlaşma we in vivo neowaskulýarlaşma pFHHSiD tarapyndan doly blokirlendi (1c, d surat, tegelekler). Bu netijeler DEET-iň selektiw M3 reseptor antagonistlerine ýa-da M3 siRNA-a duýgur ýol arkaly angiogenezi höweslendirýändigini görkezýär.
AChE DEET-iň molekulýar nyşanydyr. AChE ingibitorlary hökmünde hereket edýän donepezil ýaly dermanlar EK angiogenezini in vitro we syçanlaryň arka aýaklarynyň işemiýa modellerinde höweslendirip biler14. Biz HUVEC-de AChE fermentiniň işjeňligine DEET-iň iki konsentrasiýasynyň täsirini synagdan geçirdik. DEET-iň pes (10-8 M) we ýokary (10-5 M) konsentrasiýalary gözegçilik şertlerine garanyňda endotelial AChE işjeňligini peseltdi (2-nji surat).
DEET-iň iki konsentrasiýasy (10-8 M we 10-5 M) HUVEC-de asetilholinesteraza işjeňligini peseltdi. BW284c51 (10-5 M) asetilholinesteraza ingibitorlary üçin gözegçilik hökmünde ulanyldy. Netijeler, DEET-iň iki konsentrasiýasy bilen bejerilen HUVEC-de AChE işjeňliginiň prosenti hökmünde, ulag bilen bejerilen öýjükler bilen deňeşdirilende görkezilýär. Bahalar alty garaşsyz synagyň ortaça ± SEM hökmünde görkezilýär. *p < 0.05, gözegçilik bilen deňeşdirilende (Kruskal-Wallis we Dann köptaraplaýyn deňeşdirme synagy).
Azot oksidi (NO) angiogen prosesde 33 gatnaşýar, şonuň üçin DEET bilen höweslendirilýän HUVEC-lerde NO önümçiligi öwrenildi. DEET bilen bejerilen endotelial NO önümçiligi gözegçilik öýjüklerine garanyňda artdy, ýöne diňe 10-8 M dozada ähmiýete ýetdi (3c-nji surat). DEET bilen bejerilen NO önümçiligini dolandyrýan molekulýar üýtgeşmeleri kesgitlemek üçin eNOS ekspresiýasy we aktiwleşdirilişi Western blotting arkaly seljerildi. DEET bilen bejeriliş eNOS ekspresiýasyny üýtgetmese-de, eNOS fosforilleşdirilişinde işlenilmedik öýjüklere garanyňda, aktiwleşdiriji ýerinde (Ser-1177) eNOS fosforilleşdirilişini ep-esli artdyrdy we onuň tormozlaýjy ýerini (Thr-495) azaldy (3d-nji surat). Mundan başga-da, aktiwleşdiriliş ýerinde we tormozlaýjy ýerinde fosforilleşdirilen eNOS-yň gatnaşygy fosforilleşdirilen eNOS-yň mukdaryny fermentiň umumy mukdaryna kadalaşdyrandan soň hasaplanyldy. Bu gatnaşyk DEET-iň her bir konsentrasiýasy bilen bejerilen HUVEC-lerde işlenilmedik öýjüklere garanyňda ep-esli ýokarlandy (3d-nji surat).
Ahyrsoňy, esasy proangiogen faktorlaryň biri bolan VEGF-iň ekspresiýasy Western blotting arkaly seljerildi. DEET VEGF ekspresiýasyny ep-esli ýokarlandyrdy, pFHHSiD bolsa bu ekspresiýany doly blokirledi.
DEET-iň täsiri farmakologik blokada we M3 reseptorlarynyň peselmegine duýgur bolany üçin, biz DEET-iň kalsiý signalyny güýçlendirip biljekdigi baradaky gipotezany synagdan geçirdik. Geň galdyryjy zat, DEET ulanylan iki konsentrasiýa üçin hem HUVEC-de (maglumatlar görkezilmedik) we HEK/M3-de (4a, b surat) sitoplazmatik kalsiýi köpeltmedi.
Ýerleşdirilen wagty: 2024-nji ýylyň 30-njy dekabry