Anthelmintiki derman N, N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE-ni (asetilkolinesteraz) saklaýandygy we aşa damarlaşma sebäpli kanserogen häsiýetlere eýe bolandygy habar berildi. Bu ýazgyda, DEET-iň angiogeneziň ösmegine itergi berýän endotel öýjüklerini ýörite höweslendirýändigini we şeýlelik bilen çişiň ösmegini görkezýäris. DEET köpelmegi, göçmegi we ýelmeşmegi ýaly angiogenezine alyp barýan öýjükli amallary işjeňleşdirýär. Bu endotel öýjüklerinde NOOK önümçiliginiň we VEGF aňlatmasynyň ýokarlanmagy bilen baglanyşykly. M3-i dymdyrmak ýa-da farmakologiki M3 inhibitorlaryny ulanmak, bu täsirleriň hemmesini ýatyrdy, DEET-den gelýän angiogeneziň M3 duýgurlygyny görkezýär. Endotel we HEK öýjüklerinde kalsiý duýduryşyny öz içine alýan synaglar, M3 reseptorlaryny aşa aşa gysmak, şeýle hem hökmany we doklama barlaglary DEET-iň M3 reseptorlarynyň allosteriki modulýatory hökmünde işleýändigini görkezýär. Mundan başga-da, DEET AChE-ni saklaýar, şeýlelik bilen asetilkoliniň bio-elýeterliligini we M3 reseptorlary bilen baglanyşygyny ýokarlandyrýar we allosteriki kadalaşdyrmak arkaly proangiogen täsirleri güýçlendirýär.
Ilkinji EC-ler Şweýsariýaly syçanlaryň aortasyndan izolirlendi. Gazyp almak usuly 26-njy Kobaýaşi protokolyndan uýgunlaşdyryldy. Murin EC-leri, dördünji geçişe çenli 5% ýylylyk hereketsiz FBS bilen doldurylan EBM-2 gurşawynda ösdürilip ýetişdirildi.
DEET-iň iki konsentrasiýasynyň HUVEC, U87MG ýa-da BF16F10 ýaýramagyna täsiri CyQUANT öýjükleriniň ýaýramagynyň barlag toplumy (Molekulýar problar, C7026) arkaly derňeldi. Gysgaça aýdanyňda, bir guýy üçin 5.103 öýjük 96 guýy tarelkä tohumlandy, bir gije birikdirmäge rugsat berildi we soňra DEET bilen 24 sagadyň dowamynda bejerildi. Ösüş gurşawyny aýyranyňyzdan soň, mikroplatyň her guýusyna boýag baglaýjy ergin goşuň we öýjükleri 37 ° C-de 30 minut inkubasiýa ediň. Floresan derejesi 485 nm tolgundyryjy süzgüç we 530 nm zyňyndy süzgüçleri bilen enjamlaşdyrylan Mithras LB940 multimodly mikroplat okyjy (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germaniýa) arkaly kesgitlenildi.
HUVEC 96 guýy tarelkede 104 guýy dykyzlygynda ekildi. Öýjükler 24 sagat DEET bilen bejerildi. Öýjükleriň ýaşaýyş ukyplylygy, kolorimetriki MTT barlagy (Sigma-Aldriç, M5655) ulanylyp baha berildi. Optiki dykyzlyk bahalary 570 nm tolkun uzynlygynda multimodly mikroplat okyjyda (Mithras LB940) alyndy.
DEET-iň täsiri in vitro angiogenez barlaglary arkaly öwrenildi. 10-8 M ýa-da 10-5 M DEET bilen bejermek, HUVEC-lerde kapilýar uzynlygynyň emele gelmegini ýokarlandyrdy (1a surat, b, ak barlar). Dolandyryş topary bilen deňeşdirilende, 10-14-den 10-5 M aralygynda DEET konsentrasiýalary bilen bejermek, kapilýar uzynlygynyň 10-8 M DEET-de platosa ýetendigini görkezdi (S2 goşmaça surat). 10-8 M we 10-5 M konsentrasiýa aralygynda DEET bilen bejerilen HUVEC-leriň in vitro proangiogen täsirinde düýpli tapawut tapylmady.
DEET-iň newaskulizasiýa täsirini kesgitlemek üçin, wivo newaskulyarizasiýa gözleglerinde etdik. 14 günden soň, 10-8 M ýa-da 10-5 M DEET bilen örtülen endotel öýjüklerine sanjym edilen syçanlar gemoglobiniň düzüminiň ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi (1-nji surat, ak barlar).
Mundan başga-da, DEET bilen döredilen newaskulyarizasiýa U87MG ksenograft göteriji syçanlarda öwrenildi, her gün (ip) DEET bilen sanjym edilen adamlarda adaty bolan 10-5 M plazma konsentrasiýasyny ýüze çykarýan dozada sanjym edildi. U87MG öýjüklerini syçanlara sanjymdan 14 gün soň ýüze çykarylýan çişler (ýagny çişler> 100 mm3) ýüze çykdy. 28-nji gün, gözegçilik syçanlary bilen deňeşdirilende DEET bejergisi bolan syçanlarda çişiň ösüşi ep-esli ýokarlandy (1-nji surat, kwadratlar). Mundan başga-da, CD31 çişleriň boýagy DEET-iň kapilýar meýdanyny ep-esli ýokarlandyrandygyny, ýöne mikrosesseliň dykyzlygyny görkezmedi. (1e - g).
DETA bilen örtülen köpelmekde muskarin reseptorlarynyň roluny kesgitlemek üçin, pFHHSiD (10-7 M, saýlama M3 reseptor antagonisti) bolan 10-8 M ýa-da 10-5 M DETA ulanyldy. HUVEC bejergisi. pFHHSiD ähli konsentrasiýalarda DETA-nyň köpelme häsiýetlerini doly petikledi (1-nji tablisa).
Bu şertlerde DEET-iň HUVEC öýjüklerinde kapilýar uzynlygyny ýokarlandyrjakdygyny ýa-da ýokdugyny gözden geçirdik. Şonuň ýaly-da, pFHHSiD DEET bilen örtülen kapilýar uzynlygynyň ep-esli öňüni aldy (1a surat, b, çal barlar). Mundan başga-da, şuňa meňzeş synaglar M3 siRNA bilen geçirildi. Dolandyryş siRNA kapilýarlaryň emele gelmegine täsir etmese-de, M3 muskarin reseptorynyň dymmagy DEET-iň kapilýar uzynlygyny ýokarlandyrmak ukybyny ýatyrdy (1a surat, b, gara barlar).
Mundan başga-da, vitro-da 10-8 M ýa-da 10-5 M DEET bilen örtülen damarlaşma we wivo-da newaskulyarizasiýa pFHHSiD (1-nji surat, d, tegelek) bilen doly petiklendi. Bu netijeler, DEET-iň saýlama M3 reseptor antagonistlerine ýa-da M3 siRNA duýgur ýol arkaly angiogeneziň ösýändigini görkezýär.
AChE DEET-iň molekulýar nyşanydyr. AChE inhibitorlary hökmünde hereket edýän donepezil ýaly dermanlar vitro we syçanjygyň arka işemiýa modellerinde EC angiogenezini stimulirläp biler14. DEET iki konsentrasiýasynyň HUVEC-de AChE ferment işjeňligine täsirini barladyk. DEET-iň pes (10-8 M) we ýokary (10-5 M) konsentrasiýalary gözegçilik şertleri bilen deňeşdirilende endotel AChE işjeňligini peseldi (2-nji surat).
DEET-iň iki konsentrasiýasy (10-8 M we 10-5 M) HUVEC-de asetilkolinesteraz işjeňligini peseltdi. BW284c51 (10-5 M) asetilkolinesteraz ingibitorlaryna gözegçilik hökmünde ulanyldy. Netijeler, ulagda bejerilen öýjükler bilen deňeşdirilende DEET-iň iki konsentrasiýasy bilen bejerilen HUVEC-de AChE işjeňliginiň göterimi hökmünde aňladylýar. Gymmatlyklar alty sany garaşsyz synagyň ortaça ± SEM görnüşinde aňladylýar. * p <0.05 gözegçilik bilen deňeşdirilende (Kruskal-Wallis we Dunn köp deňeşdirme synagy).
Azot oksidi () OK) angiogen prosesine gatnaşýar 33, şonuň üçin DEET-stimulirlenen HUVEC-lerde hiç hili önümçilik öwrenilmedi. DEET bilen bejerilen endotel NOOK gözegçilik öýjükleri bilen deňeşdirilende köpelmedi, ýöne diňe 10-8 M dozada ähmiýete eýe boldy (3-nji surat). DEET-induksion NOOK önümçiligine gözegçilik edýän molekulýar üýtgeşmeleri kesgitlemek üçin, eNOS aňlatmasy we işjeňleşdirilmegi Günbatar partlamalary arkaly derňeldi. DEET bejergisi eNOS aňlatmasyny üýtgetmese-de, işjeňleşýän ýerinde (Ser-1177) eNOS fosforilýasiýasyny ep-esli ýokarlandyrdy, eNOS fosforilýasiýasynyň bejerilmedik öýjükleri bilen deňeşdirilende inhibitor ýerini (Thr-495) azaldy (3-nji surat). Mundan başga-da, fosforirlenen eNOS-yň işjeňleşdirilýän ýerdäki we saklaýan ýerdäki gatnaşygy, fosforirlenen eNOS mukdaryny fermentiň umumy mukdaryna kadalaşdyrandan soň hasaplandy. Bu gatnaşygy bejerilmedik öýjükler bilen deňeşdirilende DEET-iň her konsentrasiýasy bilen bejerilen HUVEC-lerde ep-esli ýokarlandy (3-nji surat).
Ahyrynda esasy proangiogen faktorlardan biri bolan VEGF-iň aňlatmasy, Günbatar partlamasy bilen derňeldi. DEET VEGF aňlatmasyny ep-esli ýokarlandyrdy, pFHHSiD bolsa bu aňlatmany doly petikledi.
DEET-iň täsiri farmakologiki blokada we M3 reseptorlarynyň peselmegine duýgur bolansoň, DEET-iň kalsiý signalyny güýçlendirip biljekdigi baradaky çaklamany barladyk. Geň zat, DEET ulanylýan iki konsentrasiýa üçin HUVEC (maglumatlar görkezilmeýär) we HEK / M3 (4a surat, b) sitoplazmatiki kalsiý köpeldip bilmedi.
Iş wagty: 30-2024-nji dekabry