Bu gözlegde, bilelikdäki bejerginiň höweslendiriji täsirleriösümlikleriň ösüş düzgünleşdirijileri(2,4-D we kinetin) we demir oksidi nanopartikullarynyň (Fe₃O₄-NPs) *Hypericum perforatum* L.-de in vitro morfogenez we ikinji derejeli metabolit önümçiligi boýunça öwrenildi. Optimallaşdyrylan bejergi [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] ösümlik ösüş parametrlerini ep-esli gowulandyrdy: gözegçilik topary bilen deňeşdirilende ösümlik boýy 59.6%, kök uzynlygy 114.0%, tumurcuk sany 180.0% we täze kallus agramy 198.3% artdy. Bu utgaşdyrylan bejergi şeýle hem regenerasiýa netijeliligini (50.85%) ýokarlandyrdy we giperisin mukdaryny 66.6% ýokarlandyrdy. GC-MS analizi giperozidiň, β-patoliniň we setil spirtiniň ýokary mukdaryny ýüze çykardy, bu bolsa umumy pik meýdanynyň 93,36% -ni düzýär, umumy fenollaryň we flavonoidleriň mukdary bolsa 80,1% -e çenli ýokarlandy. Bu netijeler ösümlikleriň ösüş düzgünleşdirijileriniň (PGR) we Fe₃O₄ nanopartikullarynyň (Fe₃O₄-NP) organogenezi we bioaktiw birleşmeleriň toplanmagyny höweslendirmek arkaly sinergetik täsir edýändigini görkezýär, bu bolsa dermanlyk ösümlikleriň biotehnologik taýdan kämilleşdirilmegi üçin geljegi uly strategiýadyr.
Ioann worty (Hypericum perforatum L.), şeýle hem Ioann worty diýlip atlandyrylýar, Hypericaceae maşgalasyna degişli köpýyllyk ot-çöplük ösümligi bolup, ykdysady taýdan gymmaty bar.[1] Onuň potensial bioaktiw komponentlerine tebigy taninler, ksantonlar, floroglusinol, naftalindiantron (giperin we psewdogiperin), flavonoidler, fenol kislotalary we efir ýaglary girýär.[2,3,4] Ioann worty däp bolan usullar bilen köpeltilip bilner; ýöne däp bolan usullaryň möwsümleýinligi, tohumyň pes çişmegi we kesellere sezewar bolmak onuň uly möçberde ösdürilip ýetişdirilmegi we ikinji derejeli metabolitleriň yzygiderli emele gelmegi üçin mümkinçiligini çäklendirýär.[1,5,6]
Şeýlelik bilen, in vitro dokumalaryň ösdürilip ýetişdirilmegi ösümlikleriň çalt köpelmegi, germplazma serişdeleriniň saklanmagy we dermanlyk birleşmeleriň hasyllylygyny ýokarlandyrmak üçin netijeli usul hasaplanýar [7, 8]. Ösümlikleriň ösüş düzgünleşdirijileri (PGR) morfogenezi düzgünleşdirmekde möhüm rol oýnaýar we kalluslaryň we tutuş organizmleriň in vitro ösdürilip ýetişdirilmegi üçin zerurdyr. Olaryň konsentrasiýalaryny we utgaşmalaryny optimizirlemek bu ösüş prosesleriniň üstünlikli tamamlanmagy üçin örän möhümdir [9]. Şonuň üçin düzgünleşdirijileriň degişli düzümini we konsentrasiýasyny düşünmek, Sent Jon wortynyň (H. perforatum) ösüşini we dikeldiş ukybyny gowulandyrmak üçin möhümdir [10].
Demir oksidi nanopartikullary (Fe₃O₄) dokumalary ösdürmek üçin işlenip düzülen ýa-da işlenip düzülýän nanopartikullaryň bir klasydyr. Fe₃O₄ möhüm magnit häsiýetlerine, gowy biogabaryşyklylyga we ösümlikleriň ösüşini höweslendirmek we daşky gurşawyň stresini azaltmak ukybyna eýedir, şonuň üçin dokumalary ösdürmek dizaýnlarynda uly üns çekdi. Bu nanopartikullaryň mümkin ulanylyşlary öýjükleriň bölünmegini höweslendirmek, iýmit maddalarynyň özleşdirilmegini gowulandyrmak we antioksidant fermentleri işjeňleşdirmek üçin in vitro medeniýetini optimizirlemek bolup biler [11].
Nanopartikullaryň ösümlikleriň ösüşine gowy täsir edýändigini görkezse-de, *H. perforatum*-da Fe₃O₄ nanopartikullarynyň we optimizirlenen ösümlik ösüş düzgünleşdirijileriniň bilelikde ulanylmagy boýunça geçirilen barlaglar seýrek bolmagynda galýar. Bu bilim boşlugyny doldurmak üçin, bu barlag dermanlyk ösümlikleriň häsiýetlerini gowulandyrmak üçin täze düşünjeler bermek maksady bilen, olaryň bilelikdäki täsirleriniň in vitro morfogeneze we ikinji metabolit önümçiligine täsirini bahalandyrdy. Şonuň üçin bu barlagyň iki maksady bar: (1) kallus emele gelmegini, şahalaryň täzelenmegini we köklenmegini in vitro netijeli höweslendirmek üçin ösümlik ösüş düzgünleşdirijileriniň konsentrasiýasyny optimizirlemek; we (2) Fe₃O₄ nanopartikullarynyň ösüş parametrlerine in vitro täsirini bahalandyrmak. Geljekki meýilnamalara akklimatizasiýa döwründe (in vitro) gaýtadan dikeldilen ösümlikleriň ýaşaýş derejesini bahalandyrmak girýär. Bu barlagyň netijeleriniň *H. perforatum*-yň mikroköpelme netijeliligini ep-esli ýokarlandyrjakdygyna we şeýdip bu möhüm dermanlyk ösümligiň durnukly ulanylyşyna we biotehnologiýa ulanylyşyna goşant goşjakdygyna garaşylýar.
Bu gözlegde biz meýdanda ösdürilip ýetişdirilen bir ýyllyk Sent Jon wort ösümliklerinden (ene ösümlikleri) ýaprak eksplantlaryny aldyk. Bu eksplantlar in vitro medeniýet şertlerini optimizirlemek üçin ulanyldy. Kulturadan öň, ýapraklar birnäçe minutlap distillenen suwuň aşagynda gowy çaýkaldy. Soňra eksplant ýüzleri 70% etanolda 30 sekuntlap çümdürilip, soňra 10 minutlap birnäçe damja Tween 20 goşulan 1,5% natriý gipohlorit (NaOCl) erginine çümdürilip, dezinfeksiýa edildi. Ahyrsoňy, eksplantlar indiki medeniýet gurşawyna geçirilmezden öň steril distillenen suw bilen üç gezek çaýkaldy.
Indiki dört hepdede, täzelenme tizligi, her bir eksplantdaky täzelenme sany we täzelenme uzynlygy ýaly täzelenme parametrleri ölçeldi. Täzelenen täzelenmeler azyndan 2 sm uzynlyga ýetende, olar ýarym güýçli MS serişdesinden, 0,5 mg/L indolebutir turşusyndan (IBA) we 0,3% guar sakyzyndan ybarat bolan köklenme gurşawyna geçirildi. Köklenme medeniýeti üç hepde dowam etdi, şol wagtyň dowamynda köklenme tizligi, kök sany we kök uzynlygy ölçeldi. Her bir bejergi üç gezek gaýtalandy, her gaýtalanmada 10 eksplant ösdürilip, her bejergide takmynan 30 eksplant berildi.
Ösümligiň beýikligi ösümligiň düýbünden iň beýik ýapragyň ujuna çenli çyzgyç arkaly santimetrde (sm) ölçeldi. Köküň uzynlygy şitilleri üns bilen aýyryp, ösüş gurşawyny aýyrandan soň derrew millimetrde (mm) ölçeldi. Her bir ekstraplantdaky tumurcuklaryň sany her ösümlikde gönüden-göni hasaplandy. Ýapraklardaky gara tegmilleriň, ýagny düwünleriň sany wizual ölçeldi. Bu gara düwünleriň giperisin ýa-da oksidatiw tegmilleri öz içine alýan bezler bolandygyna ynanýarlar we ösümligiň bejergä bolan jogabynyň fiziologik görkezijisi hökmünde ulanylýar. Ösüş gurşawynyň hemmesi aýrylandan soň, şitilleriň täze agramy milligramm (mg) takyklyk bilen elektron terazide ölçeldi.
Kallus emele gelmeginiň tizligini hasaplamagyň usuly aşakdaky ýaly: eksplantlary dürli ösüş düzgünleşdirijilerini (kinazalar, 2,4-D we Fe3O4) öz içine alýan gurşawda dört hepdelap ösdürip ýetişdirenden soň, kallus emele getirip bilýän eksplantlaryň sany hasaplanýar. Kallus emele gelmeginiň tizligini hasaplamagyň formulasy aşakdaky ýaly:
Her bejergi üç gezek gaýtalandy, her gaýtalanmada azyndan 10 eksplant barlandy.
Regenerasiýa tizligi kallus emele gelme tapgyryndan soň tumurcuklaryň tapawutlanmagy prosesini üstünlikli tamamlan kallus dokumasynyň paýyny görkezýär. Bu görkeziji kallus dokumasynyň tapawutlanan dokuma öwrülip, täze ösümlik organlaryna öwrülmek ukybyny görkezýär.
Köklemek koeffisiýenti kökläp bilýän şahalaryň sanynyň şahalaryň umumy sanyna gatnaşygydyr. Bu görkeziji köklemek tapgyrynyň üstünligini görkezýär, bu bolsa mikroköpelmekde we ösümlikleriň köpelmeginde möhüm ähmiýete eýedir, sebäbi gowy köklemek nahallaryň ösüş şertlerinde has gowy ýaşamagyna kömek edýär.
Giperisin birleşmeleri 90% metanol bilen ekstraksiýa edildi. 1 ml metanola elli mg guradylan ösümlik materialy goşuldy we ota temperaturasynda garaňkyda, ultrases arassalaýjyda (model A5120-3YJ) 30 kHz-de 20 minutlap ultrases bilen işlenip düzüldi. Ultrases bilen işlenip düzülenden soň, nusga 15 minutlap 6000 aýlaw/minut tizlikde santrifuga edildi. Üstki gatlak ýygnaldy we giperisiniň siňdirilişi Konseýsao we beýlekiler tarapyndan beýan edilen usula laýyklykda Plus-3000 S spektrofotometri arkaly 592 nm-de ölçeldi [14].
Ösümlik ösüş düzgünleşdirijileri (PGR) we demir oksidi nanopartikullary (Fe₃O₄-NPs) bilen bejerişleriň köpüsi täzeden dikeldilen şaha ýapraklarynda gara düwünleriň emele gelmegine sebäp bolmady. 0,5 ýa-da 1 mg/L 2,4-D, 0,5 ýa-da 1 mg/L kinetin ýa-da 1, 2 ýa-da 4 mg/L demir oksidi nanopartikullary bilen bejerişleriň hiç birinde düwünler syn edilmedi. Birnäçe kombinasiýa kinetiniň we/ýa-da demir oksidi nanopartikullarynyň ýokary konsentrasiýalarynda düwünleriň ösüşiniň birneme ýokarlanandygyny görkezdi (ýöne statistik taýdan ähmiýetli däl), meselem, 2,4-D (0,5–2 mg/L) kinetin (1–1,5 mg/L) we demir oksidi nanopartikullary (2–4 mg/L) bilen utgaşdyrylanda. Bu netijeler 2-nji suratda görkezilen. Gara düwünler tebigy ýagdaýda ýüze çykýan we peýdaly giperisine baý bezleri görkezýär. Bu gözlegde gara düwünler, esasan, dokumalaryň goňurlaşmagy bilen baglanyşykly bolup, giperisin toplanmagy üçin amatly gurşawy görkezýär. 2,4-D, kinetin we Fe₃O₄ nanopartikullary bilen bejermek kallusyň ösmegine, goňurlaşmagyň azalmagyna we hlorofil mukdarynyň ýokarlanmagyna itergi berdi, bu bolsa metabolik funksiýanyň gowulanmagyna we oksidatiw zyýanyň azalmagynyň mümkindigine şaýatlyk edýär [37]. Bu gözlegde kinetiniň 2,4-D we Fe₃O₄ nanopartikullary bilen bilelikde Sent Jon wort kallusynyň ösüşine we ösüşine täsiri bahalandyryldy (3a-g surat). Öňki gözlegler Fe₃O₄ nanopartikullarynyň gömeleklere garşy we antimikrob işjeňlikleriniň bardygyny görkezdi [38, 39] we ösümlikleriň ösüş düzgünleşdirijileri bilen bilelikde ulanylanda, ösümlikleriň goranyş mehanizmlerini höweslendirip we öýjük stres indekslerini azaldyp bilýär [18]. Ikinji derejeli metabolitleriň biosintezi genetiki taýdan düzgünleşdirilse-de, olaryň hakyky önümçiligi daşky gurşaw şertlerine örän baglydyr. Metabolik we morfologiki üýtgeşmeler belli bir ösümlik genleriniň ekspresiýasyny düzgünleşdirmek we daşky gurşaw faktorlaryna jogap bermek arkaly ikinji derejeli metabolit derejesine täsir edip biler. Mundan başga-da, induktorlar täze genleriň aktiwleşmegine sebäp bolup biler, bu bolsa öz gezeginde fermentatiw işjeňligi höweslendirýär, netijede köp sanly biosintez ýollaryny işjeňleşdirýär we ikinji derejeli metabolitleriň emele gelmegine getirýär. Mundan başga-da, başga bir gözleg kölege düşürmegiň gün şöhlesine düşmegini artdyrýandygyny, şonuň bilen *Hypericum perforatum* tebigy ýaşaýan ýerinde gündizki temperatura ýokarlanýandygyny, bu bolsa giperisin hasylynyň ýokarlanmagyna hem goşant goşýandygyny görkezdi. Bu maglumatlara esaslanyp, bu gözleg demir nanopartikullarynyň dokuma medeniýetinde potensial induktorlar hökmünde roluny öwrendi. Netijeler bu nanopartikullaryň fermentatiw stimulýasiýa arkaly hesperidin biosintezine gatnaşýan genleri işjeňleşdirip biljekdigini we bu birleşmäniň toplanmagynyň artmagyna getirýändigini görkezdi (2-nji surat). Şonuň üçin, tebigy şertlerde ösýän ösümlikler bilen deňeşdirilende, ortaça stres ikinji derejeli metabolitleriň biosintezine gatnaşýan genleriň aktiwleşmegi bilen utgaşdyrylanda, şeýle birleşmeleriň in vivo önümçiliginiň hem ýokarlanyp biljekdigini öňe sürmek bolar. Kombinasiýa bejergileri, adatça, regenerasiýa tizligine oňyn täsir edýär, ýöne käbir ýagdaýlarda bu täsir gowşaýar. Belli bir zat, 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaza we dürli konsentrasiýalar bilen bejergi gözegçilik topary bilen deňeşdirilende gaýtadan dikeldilme tizligini garaşsyz we ep-esli derejede 50,85% ýokarlandyryp biler (4c-nji surat). Bu netijeler nanogormonlaryň belli bir utgaşmalarynyň ösümlikleriň ösüşini we metabolitleriň öndürilmegini höweslendirmek üçin sinergiki täsir edip biljekdigini görkezýär, bu bolsa dermanlyk ösümlikleriň dokumalarynyň ösdürilmegi üçin uly ähmiýete eýedir. Palmer we Keller [50] 2,4-D bejerginiň St. perforatumda kallusyň emele gelmegini garaşsyz ýagdaýda döredip biljekdigini, kinazyň goşulmagynyň bolsa kallusyň emele gelmegini we gaýtadan dikeldilmegini ep-esli derejede güýçlendirýändigini görkezdiler. Bu täsir gormonal deňagramlylygyň gowulanmagy we öýjük bölünişiniň höweslendirilmegi bilen baglanyşykly boldy. Bal we beýlekiler [51] Fe₃O₄-NP bejergisiniň antioksidant fermentleriň işini garaşsyz ýagdaýda güýçlendirip biljekdigini we şeýdip St. perforatumda kökleriň ösmegini höweslendirip biljekdigini anykladylar. 0,5 mg/L, 1 mg/L we 1,5 mg/L konsentrasiýalarynda Fe₃O₄ nanopartikullaryny öz içine alýan medeniýet gurşawlary zygyr ösümlikleriniň regenerasiýa tizligini ýokarlandyrdy [52]. Kinetin, 2,4-dihlorbenzotiazolinon we Fe₃O₄ nanopartikullaryny ulanmak kallus we kök emele gelme tizligini ep-esli gowulandyrdy, ýöne bu gormonlary in vitro regenerasiýa üçin ulanmagyň mümkin bolan goşmaça täsirlerini göz öňünde tutmak gerek. Mysal üçin, 2,4-dihlorbenzotiazolinon ýa-da kinetiniň uzak möhletli ýa-da ýokary konsentrasiýada ulanylmagy somatik klonal üýtgeşiklige, oksidatiw stresse, anormal kallus morfologiýasyna ýa-da witrifikasiyasyna getirip biler. Şonuň üçin ýokary regenerasiýa tizligi hökman genetiki durnuklylygy çaklamaýar. Regenerasiýa edilen ähli ösümlikler molekulýar markerler (meselem, RAPD, ISSR, AFLP) ýa-da sitogenetiki analiz arkaly bahalandyrylmaly, olaryň birmeňzeşligini we in vivo ösümliklere meňzeşligini kesgitlemek üçin [53,54,55].
Bu gözleg ilkinji gezek ösümlik ösüş düzgünleşdirijileriniň (2,4-D we kinetin) Fe₃O₄ nanopartikullary bilen bilelikde ulanylmagynyň *Hypericum perforatum*-da morfogenezi we esasy bioaktiw metabolitleriň (giperisin we giperozid bilen birlikde) toplanmagyny güýçlendirip biljekdigini görkezdi. Optimallaşdyrylan bejeriş tertibi (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) diňe bir kallus emele gelmegini, organogenezi we ikinji metabolitiň hasyllylygyny ýokarlandyrmak bilen çäklenmän, eýsem ýumşak induksiýa täsirini hem görkezdi, bu bolsa ösümligiň stres çydamlylygyny we dermanlyk gymmatyny ýokarlandyrmaga mümkinçilik berýär. Nanotehnologiýanyň we ösümlik dokumalarynyň medeniýetiniň utgaşmasy dermanlyk birleşmeleriň giň möçberli in vitro önümçiligi üçin durnukly we netijeli platforma döredýär. Bu netijeler senagat ulanylyşlary we molekulýar mehanizmler, dozany optimizirlemek we genetiki takyklyk boýunça geljekki barlaglar üçin ýol açýar, şeýlelik bilen dermanlyk ösümlikler boýunça fundamental barlaglary amaly biotehnologiýa bilen baglanyşdyrýar.
Ýerleşdirilen wagty: 2025-nji ýylyň 12-nji dekabry