Ösümlikleriň apikal meristemasynyň (SAM) ösüşi göwde gurluşy üçin örän möhümdir. Ösümlik gormonlarygibberellinler(GA) ösümlikleriň ösüşini utgaşdyrmakda möhüm rol oýnaýar, ýöne olaryň SAM-daky roly henizem gowy öwrenilmedik. Bu ýerde biz DELLA belogyny inženerçilik arkaly GA transkripsiýa jogabyndaky esasy düzgünleşdiriji funksiýasyny basyp ýatyrmak we GA ykrar edilende onuň dargamagyny saklamak arkaly GA signalynyň nisbiýometriki biosensoryny işläp düzdik. Biz bu dargama esaslanýan biosensoryň ösüş döwründe GA derejelerindäki we öýjük duýujylygyndaky üýtgeşmeleri takyk ýazýandygyny görkezýäris. Biz bu biosensory SAM-da GA signal işjeňligini kartalaşdyrmak üçin ulandyk. Biz ýokary GA signallarynyň esasan düwünara öýjükleriň öňbaşçylary bolan organ primordiýalarynyň arasynda ýerleşýän öýjüklerde bardygyny görkezýäris. Işlemegiň gazanç we ýitgi çemeleşmelerini ulanyp, biz GA-nyň öýjük bölüniş tekizliginiň ugruny düzgünleşdirýändigini, düwünara öýjükleriň kanonik öýjük gurluşyny döredýändigini we şeýdip SAM-da düwünara spesifikasiýany ýokarlandyrýandygyny has-da görkezýäris.
Çybyklaryň depesinde ýerleşýän şahanyň apikal meristemasy (SAM) ösümligiň ömrüniň dowamynda modular we gaýtalanýan görnüşde işjeňligi bilen gapdal organlary we kök düwünlerini döredýän kök öýjükleriniň bir bölegini öz içine alýar. Bu gaýtalanýan birlikleriň ýa-da ösümlik düwünleriniň her biri düwünlerdäki düwünleriň arasyndaky we gapdal organlary, şeýle hem ýaprak goltugyndaky goltugyndaky meristemalary öz içine alýar1. Ösümlik düwünleriniň ösüşi we gurluşy ösüş döwründe üýtgeýär. Arabidopsisde, düwünleriň arasyndaky ösüş wegetatiw tapgyrda basylyp galýar we goltugyndaky meristemalar rozet ýapraklarynyň goltugynda ýatyp galýar. Gül fazasyna geçiş döwründe SAM inflorescence meristemasyna öwrülýär we uzyn düwünleriň arasyndaky we goltugyndaky tumurcuklary, gül ýapraklarynyň goltugynda şahalary we soňra ýapraksyz gülleri döredýär2. Ýapraklaryň, gülleriň we şahalaryň başlangyjyny dolandyrýan mehanizmleri düşünmekde uly öňegidişlik gazanan bolsak-da, düwünleriň arasyndaky nähili döreýändigi barada deňeşdirme bilen az zat bilinýär.
GA-laryň giňişlik-wagt paýlanyşyny düşünmek, bu gormonlaryň dürli dokumalarda we dürli ösüş tapgyrlarynda funksiýalaryny has gowy düşünmäge kömek eder. Öz promotorynyň täsiri astynda beýan edilýän RGA-GFP birleşmesiniň dargamagynyň wizualizasiýa edilmegi köklerde umumy GA derejeleriniň düzgünleşdirilmegi barada möhüm maglumatlary berýär15,16. Şeýle-de bolsa, RGA ekspresiýasy dokumalarda üýtgeýär17 we GA18 tarapyndan düzgünleşdirilýär. Şeýlelik bilen, RGA promotorynyň dürli ekspresiýasy RGA-GFP bilen syn edilýän fluoresensiýa nusgasyna getirip biler we şonuň üçin bu usul mukdary däl. Ýakynda bioaktiw fluoresen (Fl) bilen belgilenen GA19,20 kök endokorteksinde GA-nyň toplanmagyny we onuň öýjük derejeleriniň GA daşamagy arkaly düzgünleşdirilmegini ýüze çykardy. Ýakynda GA FRET sensory nlsGPS1 GA derejeleriniň köklerde, filamentlerde we garaňky ösen gipokotillerde21 öýjük uzalmasy bilen baglanyşyklydygyny görkezdi. Şeýle-de bolsa, görşümiz ýaly, GA konsentrasiýasy GA signallaşdyrma işjeňligini gözegçilikde saklaýan ýeke-täk parametr däl, sebäbi ol çylşyrymly duýujy proseslere baglydyr. Bu ýerde, DELLA we GA signallaşdyrma ýollary baradaky düşünjämize esaslanyp, GA signallaşdyrmasy üçin dargama esasyndaky gatnaşykly biosensoryň işlenip düzülmegini we häsiýetlendirilmegini habar berýäris. Bu mukdary biosensory işläp düzmek üçin, biz fluoresans belogyna birleşdirilen we dokumalarda hemme ýerde ekspressiýa edilen mutant GA-duýgur RGA-ny, şeýle hem GA-duýgur bolmadyk fluoresans belogyny ulandyk. Mutant RGA belogynyň birleşmeleriniň hemme ýerde ekspressiýa edilende endogen GA signallaşdyrmasyna päsgel bermeýändigini we bu biosensoryň ýokary giňişlik-wagt çözgüdi bilen duýujy enjam tarapyndan GA girişinden we GA signalyny işläp düzmekden gelip çykýan signallaşdyrma işjeňligini kesgitläp bilýändigini görkezýäris. Biz bu biosensory GA signallaşdyrma işjeňliginiň giňişlik-wagt paýlanyşyny kartalaşdyrmak we GA-nyň SAM epidermisinde öýjük hereketini nähili düzgünleşdirýändigini kesgitlemek üçin ulandyk. Biz GA-nyň organ primordiýalarynyň arasynda ýerleşýän SAM öýjükleriniň bölüniş tekizliginiň ugruny düzgünleşdirýändigini we şonuň bilen düwünleriň arasyndaky kanoniki öýjük gurluşyny kesgitleýändigini görkezýäris.
Ahyrsoňy, biz qmRGA-nyň ösýän hipokotilleri ulanyp, endogen GA derejelerindäki üýtgeşmeleri habar berip biljekdigini soradyk. Biz öň nitratyň GA sintezini we öz gezeginde DELLA34-iň dargamagyny artdyrmak arkaly ösüşi höweslendirýändigini görkezdik. Şoňa görä, biz bol nitrat üpjünçiliginde (10 mM NO3−) ösdürilen pUBQ10::qmRGA nahallarynda gipokotil uzynlygynyň nitrat ýetmezçilik edýän şertlerde ösdürilen nahallardan has uzyndygyny gördük (Goşmaça surat 6a). Ösüş jogabyna laýyklykda, GA signallary 10 mM NO3− şertlerinde ösdürilen nahallaryň gipokotillerinde nitrat ýok ýagdaýynda ösdürilen nahallardan has ýokarydy (Goşmaça surat 6b, c). Şeýlelik bilen, qmRGA GA konsentrasiýasyndaky endogen üýtgeşmeler sebäpli GA signalyndaky üýtgeşmeleri gözegçilik etmäge hem mümkinçilik berýär.
qmRGA tarapyndan anyklanan GA signallaşdyryş işjeňliginiň sensor dizaýnyna esaslanyp garaşylyşy ýaly, GA konsentrasiýasyna we GA duýgusyna baglydygyny ýa-da bagly däldigini düşünmek üçin, biz üç GID1 reseptorynyň wegetatiw we köpeliş dokumalaryndaky ekspresiýasyny seljerdik. Şitillerde GID1-GUS habarçy liniýasy GID1a we c-niň kotiledonlarda ýokary derejede ekspresiýa edilýändigini görkezdi (3a-c surat). Mundan başga-da, üç reseptoryň hemmesi ýapraklarda, gapdal kök primordiýalarynda, kök uçlarynda (GID1b-niň kök gapjagyndan başga) we damar ulgamynda ekspresiýa edildi (3a-c surat). Gülçülik SAM-da biz diňe GID1b we 1c üçin GUS signallaryny anykladyk (Goşmaça surat 7a-c). In situ gibridizasiýa bu ekspresiýa nusgalaryny tassyklady we GID1c-niň SAM-da pes derejelerde deň derejede ekspresiýa edilýändigini, GID1b-niň bolsa SAM-yň çetki böleginde has ýokary ekspresiýa görkezýändigini has-da görkezdi (Goşmaça surat 7d-l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translýasiýa birleşmesi, SAM-yň merkezinde pes ýa-da hiç hili ekspressiýadan organ serhetlerinde ýokary ekspressiýa çenli GID1b ekspressiýasynyň derejelenen aralygyny hem ýüze çykardy (Goşmaça surat 7m). Şeýlelik bilen, GID1 reseptorlary dokumalaryň arasynda we içinde deň derejede paýlanmadyk. Soňraky tejribelerde biz GID1-iň (pUBQ10::GID1a-mCherry) artykmaç ekspressiýasynyň hipokotillerde daşarky GA ulanylyşyna qmRGA-nyň duýgurlygyny artdyrandygyny hem gördük (3d, e surat). Tersine, hipokotilde qd17mRGA bilen ölçenen fluoresensiýa GA3 bejergisine duýgur däldi (3f, g surat). Iki synag üçin hem, sensoryň çalt hereketini bahalandyrmak üçin şitiller ýokary konsentrasiýaly GA (100 μM GA3) bilen işlenildi, bu ýerde GID1 reseptoryna baglanmak ukyby güýçlendi ýa-da ýitdi. Bu netijeler bilelikde qmRGA biosensorynyň GA we GA sensory hökmünde bilelikdäki funksiýany ýerine ýetirýändigini tassyklaýar we GID1 reseptorynyň differensial ekspresiýasynyň sensoryň emissiwligini düýpli derejede üýtgedip biljekdigini görkezýär.
Häzirki güne çenli SAM-da GA signallarynyň paýlanyşy näbelli bolmagynda galýar. Şonuň üçin, biz qmRGA ekspresirleýän ösümlikleri we pCLV3::mCherry-NLS kök öýjük reporterini35 ulanyp, GA signal işjeňliginiň ýokary çözgütli mukdaryny hasapladyk, L1 gatlagyna (epidermis; 4a, b surat, Usullara we Goşmaça usullara serediň) ünsi jemledik, sebäbi L1 SAM ösüşini gözegçilikde saklamakda möhüm rol oýnaýar36. Bu ýerde, pCLV3::mCherry-NLS ekspresiýasy GA signal işjeňliginiň giňişlik-wagt paýlanyşyny seljermek üçin kesgitlenen geometrik salgylanma nokadyny üpjün etdi37. GA gapdal organlaryň ösüşi üçin möhüm hasaplansa-da4, biz P3 tapgyryndan başlap gül primordiumynda (P) GA signallarynyň pesdigini (4a, b surat), ýaş P1 we P2 primordiumlarynda bolsa merkezi sebitdäki ýaly ortaça işjeňlik bardygyny gördük (4a, b surat). Ýokary GA signallaşdyrma işjeňligi organ primordium serhetlerinde, P1/P2-den (serhediň gapdallaryndan) başlap, P4-de iň ýokary derejä ýetýän, şeýle hem primordiýalaryň arasynda ýerleşýän periferik sebitiň ähli öýjüklerinde ýüze çykaryldy (4a, b surat we Goşmaça 8a, b surat). Bu ýokary GA signallaşdyrma işjeňligi diňe bir epidermisde däl, eýsem L2 we ýokarky L3 gatlaklarynda hem syn edildi (Goşmaça 8b surat). qmRGA ulanyp SAM-da ýüze çykarylan GA signallarynyň görnüşi hem wagtyň geçmegi bilen üýtgewsiz galdy (Goşmaça 8c–f, k surat). qd17mRGA gurluşy jikme-jik häsiýetlendiren bäş garaşsyz liniýadan T3 ösümlikleriniň SAM-ynda ulgamlaýyn peseldilip bolsa-da, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP gurluşy bilen alnan fluoresensiýa nusgalaryny seljerip bildik (Goşmaça 8g–j surat, l). Bu gözegçilik çyzygynda SAM-da diňe fluoresensiýa gatnaşygynda kiçi üýtgeşmeler ýüze çykaryldy, ýöne SAM merkezinde TagBFP bilen baglanyşykly VENUS-da aýdyň we garaşylmadyk azalma boldy. Bu qmRGA tarapyndan synlanan signallaşdyrma nusgasynyň mRGA-VENUS-yň GA-garaşly dargamagyny görkezýändigini tassyklaýar, şeýle hem qmRGA-nyň meristem merkezinde GA signallaşdyrma işjeňligini ýokary baha berip biljekdigini görkezýär. Gysgaça aýdylanda, netijelerimiz esasan primordiýalaryň paýlanyşyny görkezýän GA signallaşdyrma nusgasyny görkezýär. Ilkinji ara sebitiň (IPR) bu paýlanyşy ösýän primordiýa bilen merkezi sebitiň arasynda ýokary GA signallaşdyrma işjeňliginiň ýuwaş-ýuwaşdan döredilmegi bilen baglanyşyklydyr, şol bir wagtyň özünde primordiýadaky GA signallaşdyrma işjeňligi peselýär (4c, d surat).
GID1b we GID1c reseptorlarynyň paýlanyşy (ýokardaky serediň) GA reseptorlarynyň differensial ekspresiýasynyň SAM-da GA signallaşdyryş işjeňliginiň nusgasyny emele getirmäge kömek edýändigini görkezýär. GA-nyň differensial toplanmagynyň gatnaşyp biljekdigini pikir etdik. Bu mümkinçiligi öwrenmek üçin nlsGPS1 GA FRET sensoryny ulandyk21. 100 minutlap 10 μM GA4+7 bilen işlenen nlsGPS1-iň SAM-ynda aktiwleşdiriş ýygylygynyň ýokarlanandygy anyklandy (Goşmaça surat 9a–e), bu bolsa nlsGPS1-iň köklerde bolşy ýaly SAM-da GA konsentrasiýasynyň üýtgemelerine jogap berýändigini görkezýär21. nlsGPS1 aktiwleşdiriş ýygylygynyň giňişlik paýlanyşy SAM-yň daşky gatlaklarynda GA derejeleriniň deňeşdirme boýunça pesdigini ýüze çykardy, ýöne olaryň SAM-yň merkezinde we serhetlerinde ýokarydygyny görkezdi (4e surat we Goşmaça surat 9a,c). Bu bolsa GA-nyň SAM-da qmRGA tarapyndan ýüze çykarylan giňişlik nusgasyna deňeşdirme boýunça paýlanandygyny görkezýär. Goşmaça çemeleşme hökmünde, biz SAM-y flüoresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ýa-da diňe Fl bilen negatiw gözegçilik hökmünde hem bejerdik. Fl signaly SAM-yň ähli ýerine, şol sanda merkezi sebit we primordium bilen bilelikde paýlandy, ýöne has pes intensiwlikde (4j surat we goşmaça 10d surat). Tersine, üç GA-Fl-iň hemmesi primordium serhetlerinde we IPR-iň galan böleginde dürli derejede toplandy, GA7-Fl bolsa IPR-iň iň uly domeninde toplandy (4k surat we goşmaça 10a,b surat). Flüoresans intensiwliginiň mukdaryny kesgitlemek, GA-Fl bilen işlenen SAM-da IPR-iň IPR däl intensiwlige gatnaşygynyň Fl bilen işlenen SAM-a garanyňda has ýokarydygyny görkezdi (4l surat we goşmaça 10c surat). Bu netijeler bilelikde, GA-nyň organ serhedine iň ýakyn ýerleşýän IPR öýjüklerinde has ýokary konsentrasiýalarda bardygyny görkezýär. Bu bolsa, SAM GA signallaşdyryş işjeňliginiň nusgasynyň GA reseptorlarynyň differensial ekspresiýasyndan we organ serhetlerine golaý IPR öýjüklerinde GA-nyň differensial toplanmagyndan gelip çykýandygyny görkezýär. Şeýlelik bilen, biziň derňewimiz GA signallaşdyryşynyň garaşylmadyk giňişlik-wagt nusgasyny ýüze çykardy, SAM-yň merkezinde we primordiumynda has pes işjeňlik we periferik sebitde IPR-de has ýokary işjeňlik.
SAM-da differensial GA signallaşdyryş işjeňliginiň roluny düşünmek üçin, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-iň real wagt tizlikli suratlandyryşyny ulanyp, GA signallaşdyryş işjeňliginiň, öýjük giňelmeginiň we öýjük bölünmeginiň arasyndaky arabaglanyşygy seljerdik. Ösüş düzgünleşdirişinde GA-nyň roluny göz öňünde tutup, öýjük giňeliş parametrleri bilen oňyn arabaglanyşygyň bolmagyna garaşylýardy. Şonuň üçin, ilki bilen GA signallaşdyryş işjeňliginiň kartalaryny öýjük ýüzüniň ösüş tizliginiň kartalary (berlen öýjük üçin we bölünişde gyz öýjükler üçin öýjük giňelmeginiň güýjüniň proksi hökmünde) we öýjük giňelmeginiň ugruny ölçeýän ösüş anizotropiýasynyň kartalary bilen deňeşdirdik (bu ýerde berlen öýjük we bölünişde gyz öýjükler üçin hem ulanylýar; 5a,b surat, Usullara we Goşmaça usullara serediň). SAM öýjük ýüzüniň ösüş tizliginiň kartalarymyz öňki gözegçiliklere gabat gelýär38,39, serhetde minimal ösüş tizlikleri we ösýän güllerde iň ýokary ösüş tizlikleri bilen (5a surat). Esasy komponentleriň seljermesi (PCA) GA signallaşdyryş işjeňliginiň öýjük ýüzüniň ösüş intensiwligi bilen negatiw arabaglanyşygyň bardygyny görkezdi (5c surat). Şeýle hem, GA signal girişi we ösüş intensiwligi ýaly üýtgeýişiň esasy oklarynyň ýokary CLV3 ekspresiýasy bilen kesgitlenen ugra ortogonaldygyny görkezdik, bu bolsa galan analizlerde öýjükleriň SAM merkezinden çykarylandygyny tassyklaýar. Spearman korrelasiýa analizi PCA netijelerini tassyklady (5d surat), bu bolsa IPR-däki ýokary GA signallarynyň öýjük giňelmeginiň ýokary bolmagyna getirmeýändigini görkezýär. Şeýle-de bolsa, korrelasiýa analizi GA signallaşdyrma işjeňligi bilen ösüş anizotropiýasy arasynda kiçi oňyn korrelasiýany ýüze çykardy (5c, d surat), bu bolsa IPR-däki ýokary GA signallaşdyrmasynyň öýjük ösüşiniň ugruna we mümkin bolsa öýjük bölüniş tekizliginiň ýagdaýyna täsir edýändigini görkezýär.
a, b SAM-da ortaça ýüzleý ösüşiň (a) we ösüş anizotropiýasynyň (b) ýylylyk kartalary ýedi garaşsyz ösümlik boýunça ortaça hasaplandy (degişlilikde öýjük giňelmeginiň güýji we ugry üçin proksi hökmünde ulanylýar). c PCA analizi aşakdaky üýtgeýänleri öz içine aldy: GA signaly, ýüzleý ösüş intensiwligi, ýüzleý ösüş anizotropiýasy we CLV3 ekspresiýasy. PCA komponenti 1 esasan ýüzleý ösüş intensiwligi bilen negatiw baglanyşyklydy we GA signaly bilen oňyn baglanyşyklydy. PCA komponenti 2 esasan ýüzleý ösüş anizotropiýasy bilen oňyn baglanyşyklydy we CLV3 ekspresiýasy bilen negatiw baglanyşyklydy. Göterimler her bir komponent tarapyndan düşündirilýän üýtgeşmäni görkezýär. d CZ-ni hasaba almaýan dokuma ölçeginde GA signaly, ýüzleý ösüş intensiwligi we ýüzleý ösüş anizotropiýasy arasyndaky Spearman korrelýasiýa analizi. Sagdaky san iki üýtgeýäniň arasyndaky Spearman rho gymmatydyr. Ýyldyzlar korrelýasiýa/negatiw korrelýasiýa örän ähmiýetli bolan ýagdaýlary görkezýär. e Konfokal mikroskopiýa arkaly Col-0 SAM L1 öýjükleriniň 3D wizualizasiýa. 10 sagatda SAM-da (ýöne primordiumda däl) emele gelen täze öýjük diwarlary burç gymmatlyklaryna görä reňklenýär. Reňk çyzygy aşaky sag burçda görkezilýär. Içki suratda 0 sagatda degişli 3D şekil görkezilýär. Tejribe iki gezek gaýtalandy we meňzeş netijeler berildi. f Guty çyzgylary IPR we IPR bolmadyk Col-0 SAM-da (n = 10 garaşsyz ösümlik) öýjük bölüniş tizligini görkezýär. Merkezi çyzyk medianany, guty serhetleri bolsa 25-nji we 75-nji persentilleri görkezýär. Murtlar R programma üpjünçiligi bilen kesgitlenen iň pes we iň ýokary gymmatlyklary görkezýär. P gymmatlyklary Welch-iň iki guýrukly t-testi bilen alyndy. g, h Şematik diagramma (g) täze öýjük diwarynyň (magenta) burçuny SAM-yň merkezinden radial ugur boýunça nähili ölçemelidigini görkezýär (ak nokatly çyzyk) (diňe ýiti burç gymmatlyklary, ýagny 0–90°, göz öňünde tutulýar) we (h) meristemanyň içindeki töwerekleýin/ýan we radial ugurlar. i SAM (garaňky gök), IPR (orta gök) we IPR däl (açyk gök) boýunça öýjük bölüniş tekizliginiň ugrynyň ýygylyk gistogrammalary. P gymmatlyklary iki guýrukly Kolmogorov-Smirnow synagy arkaly alyndy. Synag iki gezek gaýtalandy we meňzeş netijeler bilen. j IPR-iň degişlilikde P3 (açyk ýaşyl), P4 (orta ýaşyl) we P5 (garaňky ýaşyl) töweregindäki öýjük bölüniş tekizliginiň ugrynyň ýygylyk gistogrammalary. P gymmatlyklary iki guýrukly Kolmogorov-Smirnow synagy arkaly alyndy. Synag iki gezek gaýtalandy we meňzeş netijeler bilen.
Şonuň üçin, biz soňra synag wagtynda täze emele gelen öýjük diwarlaryny kesgitlemek arkaly GA signallaşdyrmasy bilen öýjük bölüniş işjeňliginiň arasyndaky arabaglanyşygy öwrendik (5e-nji surat). Bu çemeleşme bize öýjük bölünişiniň ýygylygyny we ugruny ölçemäge mümkinçilik berdi. Geň galdyryjy zat, biz IPR-de we SAM-yň galan böleginde (IPR däl, 5f-nji surat) öýjük bölünişiniň ýygylygynyň meňzeşdigini anykladyk, bu bolsa IPR we IPR däl öýjükleriň arasyndaky GA signallaşdyrmasyndaky tapawutlaryň öýjük bölünişine düýpli täsir etmeýändigini görkezýär. Bu we GA signallaşdyrmasy bilen ösüş anizotropiýasynyň arasyndaky oňyn arabaglanyşyk bizi GA signallaşdyrma işjeňliginiň öýjük bölüniş tekizliginiň ugryna täsir edip biljekdigini ýa-da etmejekdigini göz öňünde tutmaga itergi berdi. Biz täze öýjük diwarynyň ugruny meristem merkezini we täze öýjük diwarynyň merkezini birleşdirýän radial okuna görä ýiti burç hökmünde ölçedik (5e-i surat) we öýjükleriň radial okuna görä 90° golaý burçlarda bölünmegine aýdyň meýli synladyk, iň ýokary ýygylyklar 70–80° (23.28%) we 80–90° (22.62%) (5e,i surat) derejesinde syn edildi, bu bolsa aýlaw/kesilen ugurda öýjük bölünişlerine laýyk gelýär (5h surat). GA signalynyň bu öýjük bölüniş hereketine goşandyny öwrenmek üçin, IPR-däki we IPR däl öýjük bölüniş parametrlerini aýratynlykda seljerdik (5i surat). Biz IPR öýjüklerinde bölüniş burç paýlanyşynyň IPR däl öýjüklerdäki ýa-da tutuş SAM-daky öýjüklerdäkiden tapawutlanýandygyny, IPR öýjükleriniň lateral/tegelek öýjük bölünişleriniň has ýokary paýyny, ýagny 70–80° we 80–90° (degişlilikde 33,86% we 30,71%) görkezýändigini gördük (5i-nji surat). Şeýlelik bilen, biziň gözegçiliklerimiz ýokary GA signallaşdyrmasy bilen öýjük bölüniş tekizliginiň töweregiň ugruna golaý ugry arasyndaky baglanyşygy ýüze çykardy, bu GA signallaşdyrma işjeňligi bilen ösüş anizotropiýasynyň arasyndaky korrelasiýa meňzeşdir (5c, d surat). Bu baglanyşygyň giňişlikdäki saklanyşyny has-da anyklamak üçin, P3-den başlap, primordiumy gurşap alýan IPR öýjüklerinde bölüniş tekizliginiň ugruny ölçedik, sebäbi bu sebitde P4-den başlap iň ýokary GA signallaşdyrma işjeňligi anyklandy (4-nji surat). IPR-iň P3 we P4 töweregindäki bölüniş burçlary statistik taýdan ähmiýetli tapawutlary görkezmedi, ýöne P4 töweregindäki IPR-de lateral öýjük bölünişleriniň ýygylygynyň artandygy syn edildi (5j-nji surat). Şeýle-de bolsa, P5 töweregindäki IPR öýjüklerinde öýjük bölüniş tekizliginiň ugryndaky tapawut statistik taýdan möhüm boldy, köndelen öýjük bölünişleriniň ýygylygy keskin artdy (5j-nji surat). Bu netijeler bilelikde GA signalynyň SAM-da öýjük bölünişleriniň ugruny dolandyryp biljekdigini görkezýär, bu bolsa ýokary GA signalynyň IPR-da öýjük bölünişleriniň gapdal ugryny döredip biljekdigi baradaky öňki habarlara laýyk gelýär40,41.
IPR-däki öýjükleriň primordiýalara däl-de, eýsem düwünleriň arasynda goşuljakdygy çaklanylýar2,42,43. IPR-däki öýjük bölünişleriniň köndelen ugry, düwünleriň arasynda epidermal öýjükleriň parallel uzynlyk hatarlarynyň adaty gurluşyna getirip biler. Ýokarda beýan edilen gözegçiliklerimiz, GA signalynyň öýjük bölünişiniň ugruny düzgünleşdirmek arkaly bu prosesde rol oýnaýandygyny görkezýär.
Birnäçe DELLA genleriniň funksiýasynyň ýitmegi konstitutiw GA jogabyna getirýär we della mutantlary bu gipotezany barlamak üçin ulanylyp bilner44. Ilki bilen SAM-da bäş DELLA geniniň ekspresiýa nusgalaryny seljerdik. GUS liniýasynyň45 transkripsiýa birleşmesi GAI, RGA, RGL1 we RGL2-niň (has az derejede) SAM-da ekspresiýa edilendigini görkezdi (Goşmaça surat 11a–d). In situ gibridizasiýa GAI mRNA-nyň esasan primordiýalarda we ösýän güllerde toplanýandygyny has-da görkezdi (Goşmaça surat 11e). RGL1 we RGL3 mRNA SAM örtüginiň ähli ýerinde we köne güllerde ýüze çykaryldy, RGL2 mRNA bolsa serhet sebitinde has köp boldy (Goşmaça surat 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-nyň konfokal suratlandyrmasy in situ gibridizasiýa arkaly synlanan ekspresiýany tassyklady we RGL3 belogynyň SAM-yň merkezi böleginde toplanýandygyny görkezdi (Goşmaça surat 11i). pRGA::GFP-RGA liniýasyny ulanyp, biz RGA belogynyň SAM-da toplanýandygyny, ýöne onuň mukdarynyň P4-den başlap serhetde azalýandygyny anykladyk (Goşmaça surat 11j). Belli bir zat, RGL3 we RGA-nyň ekspresiýa nusgalary qmRGA tarapyndan anyklanylyşy ýaly IPR-de ýokary GA signallaşdyrma işjeňligi bilen gabat gelýär (4-nji surat). Mundan başga-da, bu maglumatlar ähli DELLA-laryň SAM-da ekspresiýa edilýändigini we olaryň ekspresiýasynyň umumylykda tutuş SAM-y öz içine alýandygyny görkezýär.
Soňra biz ýabany görnüşli SAM-da (Ler, gözegçilik) we gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della bäşlik (global) mutantlarynda öýjük bölüniş parametrlerini seljerdik (6a, b surat). Gyzykly tarapy, biz della global mutant SAM-da ýabany görnüşe garanyňda öýjük bölüniş burç ýygylyklarynyň paýlanyşynda statistik taýdan möhüm üýtgeşmäni synladyk (6c surat). della global mutantyndaky bu üýtgeşme 80–90° burçlaryň (34.71% garşy 24.55%) we has az derejede 70–80° burçlaryň (23.78% garşy 20.18%) ýygylygynyň artmagy bilen baglanyşykly boldy, ýagny, köndelen öýjük bölünişlerine laýyk gelýär (6c surat). Köndelen däl bölünişleriň ýygylygy (0–60°) della global mutantynda hem pesdi (6c surat). della global mutantynyň SAM-ynda köndelen öýjük bölünişleriniň ýygylygy ep-esli ýokarlandy (6b-nji surat). IPR-däki köndelen öýjük bölünişleriniň ýygylygy della global mutantynda ýabany görnüşe garanyňda has ýokarydy (6d-nji surat). IPR sebitinden daşarda ýabany görnüş öýjük bölüniş burçlarynyň has deň paýlanyşyna eýe boldy, della global mutant bolsa IPR ýaly tangensial bölünişleri has gowy görýärdi (6e-nji surat). Şeýle hem, GA toplanýan GA-aktiw mutant fonunda ga2 oksidaza (ga2ox) bäşlik mutantlarynyň (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 we ga2ox6-2) SAM-ynda öýjük bölünişleriniň ugruny kesgitledik. GA derejesiniň ýokarlanmagyna laýyklykda, bäşlik ga2ox mutant inflorescence-iň SAM-y Col-0-dan uly boldy (Goşmaça surat 12a, b) we Col-0 bilen deňeşdirilende, bäşlik ga2ox SAM öýjük bölüniş burçlarynyň tapawutly paýlanyşyny görkezdi, burç ýygylygy 50°-den 90°-e çenli ýokarlandy, ýagny ýene-de tangensial bölünişlere peýda berdi (Goşmaça surat 12a–c). Şeýlelik bilen, GA signallaşdyryşynyň we GA toplanmagynyň konstitutiw aktiwleşdirilmeginiň IPR-de we SAM-yň galan böleginde gapdal öýjük bölünişlerini döredýändigini görkezýäris.
a, b PI bilen boýalan Ler (a) we global della mutant (b) SAM-yň L1 gatlagynyň konfokal mikroskopiýa arkaly 3D wizualizasiýa. 10 sagatlyk döwürde SAM-da (ýöne primordiumda däl) emele gelen täze öýjük diwarlary görkezilýär we olaryň burç gymmatlyklaryna görä reňklenýär. Içki suratda SAM 0 sagatda görkezilýär. Reňk çyzygy aşaky sag burçda görkezilýär. (b)-däki ok global della mutantdaky deňleşdirilen öýjük faýllarynyň mysalyna görkezýär. Tejribe meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy. ce Ler we global della arasynda tutuş SAM (d), IPR (e) we IPR däl (f)-de öýjük bölüniş tekizliginiň ýygylyk paýlanyşynyň deňeşdirilmegi. P gymmatlyklary iki guýrukly Kolmogorow-Smirnow synagy arkaly alyndy. f, g Col-0 (i) we pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgen ösümlikleriniň PI bilen boýalan SAM-ynyň konfokal suratlarynyň 3D wizualizasiýa. (a, b) panelleri SAM-da 10 sagadyň dowamynda emele gelen täze öýjük diwarlaryny (ýöne primordiýalary däl) görkezýär. Tejribe meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy. h–j Col-0 we pCUC2::gai-1-VENUS ösümlikleriniň arasynda tutuş SAM-da (h), IPR (i) we IPR däl (j) ýerleşýän öýjük bölüniş tekizliginiň ýygylyk paýlanyşynyň deňeşdirilmegi. P gymmatlyklary iki guýrukly Kolmogorow-Smirnow synagy arkaly alyndy.
Soňra biz GA signallaşdyrmasynyň IPR-de, hususan-da, basylyp saklanmagynyň täsirini synagdan geçirdik. Şu maksat bilen, VENUS-a birleşdirilen dominant negatiw gai-1 belogynyň ekspresiýasyny höweslendirmek üçin kotiledon käse 2 (CUC2) promotoryny ulandyk (pCUC2::gai-1-VENUS liniýasynda). Ýabany görnüşli SAM-da CUC2 promotory P4-den başlap, serhet öýjükleri bilen birlikde SAM-daky IPR-leriň köpüsiniň ekspresiýasyny höweslendirýär we pCUC2::gai-1-VENUS ösümliklerinde hem şuňa meňzeş aýratyn ekspresiýa syn edildi (aşakda serediň). pCUC2::gai-1-VENUS ösümlikleriniň SAM ýa-da IPR-de öýjük bölüniş burçlarynyň paýlanyşy ýabany görnüşli öýjüklerden düýpli tapawutlanmady, emma garaşylmadyk ýagdaýda bu ösümliklerde IPR bolmadyk öýjükleriň 80–90° ýokary ýygylykda bölünýändigini anykladyk (6f–j surat).
Öýjük bölünişiniň ugrunyň SAM-yň geometriýasyna, hususan-da dokumalaryň egriliginiň döredýän dartgynlyk stresine baglydygy öňe sürüldi46. Şonuň üçin biz SAM-yň görnüşiniň della global mutantynda we pCUC2::gai-1-VENUS ösümliklerinde üýtgedilendigini soradyk. Öň habar berlişi ýaly12, della global mutant SAM-yň ululygy ýabany görnüşliden has ulydy (Goşmaça surat 13a, b, d). CLV3 we STM RNK-nyň in situ gibridizasiýasynda della mutantlarynda meristema giňelmegi tassyklanyldy we kök öýjük nişasynyň gapdal giňelmegi has-da görkezildi (Goşmaça surat 13e, f, h, i). Şeýle-de bolsa, SAM egriligi iki genotipde hem meňzeşdi (Goşmaça surat 13k, m, n, p). Biz gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dörtburç mutantynda ýabany görnüş bilen deňeşdirilende egrilik üýtgemezden ululygyň meňzeş artmagyny synladyk (Goşmaça surat 13c, d, g, j, l, o, p). Öýjük bölünişiniň ugurlanmasynyň ýygylygy della dörtburç mutantynda hem täsir etdi, ýöne della monolitik mutantdakydan has az derejede (Goşmaça surat 12d–f). Bu doza täsiri, egrilige täsiriniň ýoklugy bilen birlikde, Della dörtburç mutantyndaky galan RGL3 işjeňliginiň DELLA işjeňliginiň ýitmegi sebäpli öýjük bölünişiniň ugurlanmasyndaky üýtgeşmeleri çäklendirýändigini we gapdal öýjük bölünişlerinde üýtgeşmeleriň SAM geometriýasyndaky üýtgeşmelere däl-de, GA signal işjeňligindäki üýtgeşmelere jogap hökmünde bolýandygyny görkezýär. Ýokarda beýan edilişi ýaly, CUC2 promotory SAM-da IPR ekspresiýasyny P4-den başlap herekete getirýär (Goşmaça surat 14a, b) we tersine, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-yň ululygy kiçeldildi, ýöne egriligi has ýokarydy (Goşmaça surat 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiýasyndaky bu üýtgeşiklik, ýokary aýlawly stresleriň SAM merkezinden has gysga aralykda başlaýan ýabany görnüşe garanyňda mehaniki stresleriň başgaça paýlanmagyna getirip biler47. Başgaça aýdylanda, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiýasyndaky üýtgeşmeler transgen ekspresiýasy tarapyndan döredilen sebitleýin mehaniki häsiýetleriň üýtgemeginden gelip çykyp biler48. Iki ýagdaýda hem, bu biziň gözegçiliklerimizi düşündirýär, öýjükleriň aýlawly/köndelen ugur boýunça bölünmeginiň ähtimallygyny ýokarlandyrmak arkaly GA signallaşdyrmasyndaky üýtgeşmeleriň täsirini bölekleýin öwezini dolup biler.
Umumylykda, biziň maglumatlarymyz ýokary GA signalynyň IPR-de öýjük bölüniş tekizliginiň gapdal ugry boýunça işjeň rol oýnaýandygyny tassyklaýar. Şeýle hem, olar meristem egriliginiň IPR-de öýjük bölüniş tekizliginiň ugry boýunça hem täsir edýändigini görkezýär.
Ýokary GA signallaşdyrma işjeňligi sebäpli IPR-de bölüniş tekizliginiň köndelen ugry, GA-nyň epidermisde radial öýjük faýlyny öňünden gurnaýandygyny we soňra epidermal interdüňde tapyljak öýjük gurluşyny kesgitleýändigini görkezýär. Hakykatdan-da, şeýle öýjük faýllary della global mutantlaryň SAM suratlarynda ýygy-ýygydan görünýärdi (6b-nji surat). Şeýlelik bilen, SAM-da GA signallaşdyrmasynyň giňişlik nusgasynyň ösüş funksiýasyny has çuňňur öwrenmek üçin, biz ýabany görnüşli (Ler we Col-0), della global mutantlarda we pCUC2::gai-1-VENUS transgen ösümliklerinde IPR-däki öýjükleriň giňişlik gurluşyny seljermek üçin wagt aralygy suratlandyryşyny ulandyk.
Biz qmRGA-nyň IPR-däki GA signallaşdyryş işjeňliginiň P1/P2-den ýokarlanyp, P4-de iň ýokary derejä ýetendigini we bu nusganyň wagtyň geçmegi bilen üýtgewsiz galandygyny anykladyk (4a–f surat we 8c–f goşmaça surat, k). GA signalynyň artmagy bilen IPR-däki öýjükleriň giňişlik gurluşyny seljermek üçin, ilkinji gözegçilikden 34 sagat soň seljerilen ösüş ykbalyna görä, ýagny iki plastidden köp wagt geçensoň, P4-iň ýokarsynda we gapdallarynda Ler IPR öýjüklerini belgiledik, bu bolsa bize P1/P2-den P4-e çenli primordium ösüş döwründe IPR öýjüklerini yzarlamaga mümkinçilik berdi. Biz üç dürli reňk ulandyk: P4-iň golaýynda primordiuma goşulan öýjükler üçin sary, IPR-de bolanlar üçin ýaşyl we iki prosesse gatnaşanlar üçin gyrmyzy (7a–c surat). t0-da (0 sagat), P4-iň öňünde 1-2 gatlak IPR öýjükleri görünýärdi (7a surat). Garaşylyşy ýaly, bu öýjükler bölünende, esasan, köndelen bölüniş tekizligi arkaly bölündiler (7a–c suratlar). Şuňa meňzeş netijeler Col-0 SAM ulanylyp alyndy (Lerde P4-e meňzeş gyralary bolan P3-e ünsi jemlemek bilen), emma bu genotipde gül serhedinde emele gelen gyra IPR öýjüklerini has çalt gizledi (7g–i surat). Şeýlelik bilen, IPR öýjükleriniň bölüniş görnüşi öýjükleri düwünler arasyndaky ýaly radial hatarlara öňünden guraýar. Radial hatarlaryň guralyşy we IPR öýjükleriniň yzygiderli organlaryň arasynda ýerleşmegi bu öýjükleriň düwünler arasyndaky başlangyçlardygyny görkezýär.
Bu ýerde biz GA we GA reseptorlarynyň birleşdirilen konsentrasiýalaryndan gelip çykýan GA signallaşdyryş işjeňliginiň mukdaryny kartalaşdyrmaga mümkinçilik berýän, şol bir wagtyň özünde endogen signallaşdyryş ýollaryna päsgelçiligi azaltmaga mümkinçilik berýän, şeýlelik bilen öýjük derejesinde GA funksiýasy barada maglumat berýän nisbi GA signallaşdyryş biosensoryny, qmRGA-ny işläp düzdik. Şu maksat bilen, biz DELLA özara täsirdeş hyzmatdaşlaryny baglanyşdyrmak ukybyny ýitiren, ýöne GA tarapyndan döredilen proteolize duýgur bolup galan üýtgedilen DELLA belogyny, mRGA-ny gurduk. qmRGA GA derejelerindäki ekzogen we endogen üýtgeşmelere jogap berýär we onuň dinamiki duýujy häsiýetleri ösüş döwründe GA signallaşdyryş işjeňligindäki giňişlik-wagt üýtgeşmelerini bahalandyrmaga mümkinçilik berýär. qmRGA şeýle hem örän çeýe guraldyr, sebäbi ony ekspressiýa üçin ulanylýan promotory üýtgetmek arkaly dürli dokumalara uýgunlaşdyryp bolýar (zerur bolsa) we GA signallaşdyryş ýolunyň we angiospermlerde PFYRE motiwiniň saklanan tebigatyny göz öňünde tutup, onuň beýleki görnüşlere geçirilmegi mümkin22. Muňa laýyklykda, tüwi SLR1 DELLA belogyndaky (HYY497AAA) deň mutasiýanyň hem SLR1-iň ösüş basyş ediji işjeňligini basyp ýatyrýandygy we mRGA23-e meňzeş GA arkaly dargamagyny diňe birneme azaldýandygy görkezildi. Aýratyn hem, Arabidopsis-de geçirilen soňky barlaglar PFYRE domenindäki (S474L) ýekeje aminokislota mutasiýasynyň RGA-nyň transkripsiýa işjeňligini transkripsiýa faktory hyzmatdaşlary bilen özara täsirleşmek ukybyna täsir etmezden üýtgedendigini görkezdi50. Bu mutasiýa mRGA-da bar bolan 3 aminokislota çalşygyna örän ýakyn bolsa-da, biziň barlaglarymyz bu iki mutasiýanyň DELLA-nyň aýry-aýry häsiýetlerini üýtgedýändigini görkezýär. Transkripsiýa faktory hyzmatdaşlarynyň köpüsi DELLA26,51-iň LHR1 we SAW domenlerine baglansa-da, PFYRE domenindäki käbir saklanan aminokislotalar bu özara täsirleri durnuklaşdyrmaga kömek edip biler.
Düwünleriň arasyndaky ösüş ösümlik arhitekturasynda we hasyllylygyň ýokarlanmagynda esasy aýratynlykdyr. qmRGA IPR düwünleriň arasyndaky başlangyç öýjüklerde ýokary GA signal işjeňligini ýüze çykardy. Mukdar taýdan şekillendirmegi we genetikany birleşdirip, biz GA signal şablonlarynyň SAM epidermisinde tegelek/köndele öýjük bölüniş tekizlikleriniň üst-üst düşýändigini we düwünleriň arasyndaky ösüş üçin zerur bolan öýjük bölüniş guramasyny emele getirýändigini görkezdik. Ösüş döwründe öýjük bölüniş tekizliginiň ugrunyň birnäçe düzgünleşdirijisi anyklandy52,53. Biziň işimiz GA signal işjeňliginiň bu öýjük parametrini nähili düzgünleşdirýändiginiň aýdyň mysalyny görkezýär. DELLA öňünden gatlanýan belok kompleksleri bilen özara täsirleşip bilýär41, şonuň üçin GA signaly kortikal mikrotubula ugryna gönüden-göni täsir etmek arkaly öýjük bölüniş tekizliginiň ugruny düzgünleşdirip biler40,41,54,55. Biz garaşylmadyk ýagdaýda SAM-da ýokary GA signal işjeňliginiň özara baglanyşygynyň öýjük uzalmagy ýa-da bölünmegi däl-de, diňe ösüş anizotropiýasydygyny görkezdik, bu bolsa GA-nyň IPR-de öýjük bölünişiniň ugryna gönüden-göni täsiri bilen gabat gelýär. Şeýle-de bolsa, bu täsiriň gytaklaýyn bolup biljekdigini hem aradan aýryp bilmeris, mysal üçin, GA tarapyndan döredilen öýjük diwarynyň ýumşamagy bilen amala aşyrylýar56. Öýjük diwarynyň häsiýetleriniň üýtgemegi mehaniki stres döredýär57,58, bu bolsa kortikal mikrotubulalaryň ugruna täsir edip, öýjük bölüniş tekizliginiň ugruna hem täsir edip biler39,46,59. GA tarapyndan döredilen mehaniki stres we GA tarapyndan mikrotubulalaryň ugruna gönüden-göni düzgünleşdirilmegiň bilelikdäki täsirleri, IPR-de öýjük bölüniş ugruna aýratyn bir nusgany döretmekde, interdüşleri kesgitlemekde gatnaşyp biler we bu pikiri barlamak üçin goşmaça gözlegler gerek. Şonuň ýaly-da, öňki gözlegler DELLA bilen özara täsirleşýän TCP14 we 15 beloklarynyň interdüşleriň emele gelmeginiň gözegçiliginde ähmiýetini görkezdi60,61 we bu faktorlar interdüşleriň ösüşini düzgünleşdirýän we GA signalyna täsir edýändigi görkezilýän BREVIPEDICELLUS (BP) we PENNYWISE (PNY) bilen bilelikde GA-nyň täsirini amala aşyryp biler2,62. DELL-leriň brassinosteroid, etilen, jasmon turşusy we absis turşusy (ABA) signal ýollary bilen özara täsirleşýändigini63,64 we bu gormonlaryň mikrotubulalaryň ugruna65 täsir edip bilýändigini göz öňünde tutup, GA-nyň öýjük bölüniş ugruna täsiri beýleki gormonlar arkaly hem amala aşyrylyp bilner.
Irki sitologiki barlaglar Arabidopsis SAM-nyň içki we daşky sebitleriniň düwünleriň arasyndaky ösüş üçin zerurdygyny görkezdi2,42. GA-nyň içki dokumalarda öýjük bölünişini işjeň düzgünleşdirýändigi12, SAM-da meristemany we düwünleriň arasyndaky ululygy düzgünleşdirmekde GA-nyň iki funksiýasyny goldaýar. Ugurly öýjük bölünişiniň nusgasy içki SAM dokumasynda hem berk düzgünleşdirilýär we bu düzgünleşdiriş kök ösüşi üçin möhümdir52. GA-nyň içki SAM guramasynda öýjük bölüniş tekizligini gönükdirmekde, şeýlelik bilen SAM-yň içinde düwünleriň aýratynlyklaryny we ösüşini sinhronlaşdyrmakda hem rol oýnaýandygyny öwrenmek gyzykly bolar.
Ösümlikler in vitro ýagdaýda toprakda ýa-da 1% saharoza we 1% agar (Sigma) goşulan 1x Murashige-Skoog (MS) ortamynda (Duchefa) standart şertlerde (16 sagat ýagtylyk, 22 °C) ösdürilip ýetişdirildi, gipokotil we kök ösüş tejribelerinde bolsa, bu tejribelerde şitiller dik plitalarda hemişelik ýagtylyk we 22 °C astynda ösdürilip ýetişdirildi. Nitrat tejribeleri üçin ösümlikler uzak gün şertlerinde ýeterlik nitrat (0 ýa-da 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-suksinat, 1% saharoza we 1% A-agar (Sigma) goşulan üýtgedilen MS ortamynda (bioWORLD ösümlik ortamynda) ösdürilip ýetişdirildi.
pDONR221-e girizilen GID1a kDNK-sy pUBQ10::GID1a-mCherry döretmek üçin pB7m34GW-a pDONR P4-P1R-pUBQ10 we pDONR P2R-P3-mCherry bilen gaýtadan birleşdirilip, pUBQ10::GID1a-mCherry döredildi. pDONR221-e girizilen IDD2 DNK-sy p35S:IDD2-RFP döretmek üçin pB7RWG266-a gaýtadan birleşdirildi. pGID1b::2xmTQ2-GID1b döretmek üçin, GID1b kodlaýyş sebitiniň ýokarky akymynda 3.9 kb bölek we GID1b kDNK-ny (1.3 kb) we terminatory (3.4 kb) öz içine alýan 4.7 kb bölek ilki Goşmaça 3-nji tablisadaky praýmerler arkaly güýçlendirildi we soňra degişlilikde pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) we pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) girizildi we ahyrsoňy Gateway klonlamasy arkaly pDONR221 2xmTQ268 bilen pGreen 012567 nyşana wektoryna gaýtadan birleşdirildi. pCUC2::LSSmOrange döretmek üçin, CUC2 promotor yzygiderliligi (ATG-den 3229 bp ýokarky akymynda), soňra bolsa N7 ýadro lokalizasiýa signaly we NOS transkripsiýa terminatory bilen uly Stokes-süýşürilen mOrange (LSSmOrange)69 kodlaýyş yzygiderliligi Gateway 3-fragment rekombinasiýa ulgamy (Invitrogen) ulanylyp, pGreen kanamisin nyşana alyş wektoryna ýygnaldy. Ösümlik binar wektory Agrobacterium tumefaciens GV3101 ştammyna girizildi we degişlilikde Agrobacterium infiltrasiýa usuly bilen Nicotiana benthamiana ýapraklaryna we gül çümdürme usuly bilen Arabidopsis thaliana Col-0-a girizildi. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry we pCLV3::mCherry-NLS qmRGA degişlilikde haçlaryň F3 we F1 nesillerinden bölünip alyndy.
RNK in situ gibridizasiýa takmynan 1 sm uzynlykdaky şahalaryň uçlarynda geçirildi72, olar ýygnaldy we derrew 4 °C-a çenli sowadylan FAA ergininde (3.7% formaldegid, 5% sirke turşusy, 50% etanol) berkidildi. 2 × 15 minutlyk wakuum işlemelerinden soň, fiksator çalşyryldy we nusgalar gije inkubasiýa edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 we RGL3 kDNK-lary we antisens zondlary Rosier we beýlekiler tarapyndan beýan edilişi ýaly 3-nji goşmaça tablisada görkezilen praýmerler arkaly sintez edildi73. Digoksigenin bilen belgilenen zondlar digoksigenin antitelalary (3000 esse suwuklandyrylan; Roche, katalog belgisi: 11 093 274 910) arkaly immunodeteksiýa edildi we kesikler 5-bromo-4-hlor-3-indolil fosfat (BCIP, 250 esse suwuklandyrylan) / nitroblue tetrazolium (NBT, 200 esse suwuklandyrylan) ergini bilen boýaldy.
Ýerleşdirilen wagty: 2025-nji ýylyň 10-njy fewraly