Apical meristemiň (SAM) ösmegi, arhitektura üçin möhümdir. Ösümlik gormonlarygibberellinler(GA) ösümlikleriň ösüşini utgaşdyrmakda möhüm rol oýnaýar, ýöne olaryň SAM-daky roly gaty gowy düşünilmän galýar. Bu ýerde, GA transkripsiýa jogabynda esasy kadalaşdyryjy funksiýasyny basyp ýatyrmak bilen DELLA belogyny in engineeringener edip, GA duýduryşynyň ratiometrik biosensoryny taýýarladyk, GA ykrar edilenden soň zaýalanmagyny sakladyk. Bu zaýalanmaga esaslanýan biosensoryň ösüş döwründe GA derejesindäki üýtgeşmeleri we öýjükli duýgurlygy takyk ýazýandygyny görkezýäris. SAM-da GA signalizasiýa işjeňligini kartalaşdyrmak üçin bu biosensordan peýdalandyk. GAokary GA signallarynyň, esasan, internod öýjükleriniň başlangyjy bolan organ primordiýasynyň arasynda ýerleşýän öýjüklerde bardygyny görkezýäris. Girdeji gazanmak we ýitirmek çemeleşmelerini ulanyp, GA-nyň öýjük bölüniş tekizliginiň ugruny kadalaşdyrýandygyny, internodlaryň kanoniki öýjükli guramasyny döredip, şeýlelik bilen SAM-da internod spesifikasiýasyny öňe sürýändigini görkezýäris.
Atyş depesinde ýerleşýän atyş apical meristem (SAM), öýjükleriň bir bölegini öz içine alýar, işjeňligi ösümligiň bütin ömründe modul we gaýtalanma görnüşinde gapdal organlary we baldak düwünlerini döredýär. Bu gaýtalanýan birlikleriň ýa-da ösümlik düwünleriniň hersinde düwünlerdäki internodlar we gapdal organlar, ýaprak oklarynda oklar meristemleri bar. Ösümlik düwünleriniň ösüşi we guralyşy ösüş döwründe üýtgeýär. “Arabidopsis” -de wegetatiw döwürde internodal ösüş basylýar we rozet ýapraklarynyň oklarynda aksillary meristemler ýatda galýar. Gül fazasyna geçiş döwründe SAM inflorescence meristemine öwrülýär, uzyn internodlary we ok oklaryny, kaulin ýapraklarynyň oklarynda şahalary, soň bolsa ýapraksyz gülleri döredýär2. Leavesapraklaryň, gülleriň we şahalaryň başlangyjyna gözegçilik edýän mehanizmlere düşünmekde ep-esli öňegidişlik gazanan bolsak-da, internodlaryň döremegi barada känbir bilinmeýär.
GA-laryň spatiotemporal paýlanyşyna düşünmek, bu gormonlaryň dürli dokumalarda we dürli ösüş etaplarynda işleýşine has gowy düşünmäge kömek eder. Öz höweslendirijisiniň hereketi bilen beýan edilen RGA-GFP birleşmesiniň zaýalanmagyny wizuallaşdyrmak, kökleriň umumy GA derejesini kadalaşdyrmak barada möhüm maglumatlary berýär15,16. Şeýle-de bolsa, RGA aňlatmasy dokumalar boýunça üýtgeýär17 we GA18 bilen kadalaşdyrylýar. Şeýlelik bilen, RGA höweslendirijisiniň diferensial aňlatmasy, RGA-GFP bilen synlanan floresan nagşyna sebäp bolup biler we şeýlelik bilen bu usul mukdar däl. Recentlyaňy-ýakynda, bioaktiw floresan (Fl) belgili GA19,20 kök endokorteksinde GA-nyň ýygnanmagyny we öýjükli transport derejesini GA transporty bilen kadalaşdyrýandygyny ýüze çykardy. Recentlyakynda, GA FRET datçigi nlsGPS1, GA derejeleriniň köklerde, filamentlerde we gara reňkli gipokotillerde öýjükleriň uzalmagy bilen arabaglanyşygyny görkezdi21. Şeýle-de bolsa, görşümiz ýaly, GA konsentrasiýasy GA duýduryş işjeňligini dolandyrýan ýeke-täk parametr däl, sebäbi çylşyrymly duýgurlyk proseslerine bagly. Bu ýerde, DELLA we GA signalizasiýa ýollaryna düşünişimize esaslanyp, GA signalizasiýasy üçin degradasiýa esasly ratiometrik biosensoryň ösüşini we häsiýetnamasyny habar berýäris. Bu mukdar biosensory ösdürmek üçin, floresan beloga birleşdirilen we dokumalarda hemme ýerde aňladylýan mutant GA duýgur RGA ulandyk, şeýle hem GA duýgur floresan belogy. Mutant RGA belok birleşmeleriniň hemme ýerde beýan edilende endogen GA signalizasiýasyna päsgel bermeýändigini we bu biosensoryň duýgur giriş enjamy tarapyndan GA girişiniň we GA signalynyň gaýtadan işlenmegi netijesinde ýüze çykýan signal işjeňligini kesgitläp biljekdigini görkezýäris. GA signalizasiýa işjeňliginiň spatiotemporal paýlanyşyny kartalaşdyrmak we GA-nyň SAM epidermisinde öýjükli hereketi nädip kadalaşdyrýandygyny kesgitlemek üçin bu biosensordan peýdalandyk. GA-nyň organ primordiýasynyň arasynda ýerleşýän SAM öýjükleriniň bölüniş tekizliginiň ugruny kadalaşdyrýandygyny, şeýlelik bilen internodyň kanoniki öýjükli guramasyny kesgitleýändigini görkezýäris.
Ahyrynda, qmRGA ösýän gipokotilleri ulanyp, endogen GA derejesindäki üýtgeşmeleri habar berip biljekdigini soradyk. Nitratyň GA sintezini ýokarlandyrmak we öz gezeginde DELLA34 zaýalanmagy bilen ösüşi höweslendirýändigini görkezipdik. Şoňa görä-de, köp nitrat üpjünçiligi (10 mM NO3−) bilen ösdürilip ýetişdirilýän pUBQ10 :: qmRGA nahallarynda gipokotiliň uzynlygy nitrat ýetmezçiligi şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen nahallardan ep-esli uzyn bolandygyny gördük (Goşmaça 6a surat). Ösüşe jogap bermek bilen, GA signallary 10 mM NO3− şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen nahallaryň gipokotillerinde nitrat ýok mahaly ösdürilip ýetişdirilen nahallara garanyňda has ýokarydy (Goşmaça 6b, c). Şeýlelik bilen, qmRGA GA konsentrasiýasynyň endogen üýtgemeleri netijesinde ýüze çykan GA signalynyň üýtgemegine gözegçilik etmäge mümkinçilik berýär.
QmRGA tarapyndan ýüze çykarylan GA signalizasiýa işjeňliginiň GA konsentrasiýasyna we datçigiň dizaýnyna garaşylşy ýaly GA duýgusyna baglydygyna düşünmek üçin üç sany GID1 reseptorynyň wegetatiw we köpeliş dokumalarynda görkezilmegini seljerdik. Fidanlarda GID1-GUS habarçy setiri GID1a we c-iň kotiledonlarda ýokary derejede görkezilendigini görkezdi (3a - c). Mundan başga-da, üç reseptoryň hemmesi ýapraklarda, gapdal kök primordiýada, kök uçlarynda (GID1b kök ýapgysyndan başga) we damar ulgamynda (3a - c) aňladyldy. Inflorescence SAM-da diňe GID1b we 1c üçin GUS signallaryny tapdyk (Goşmaça 7a - c). Situ gibridizasiýasy bu aňlatma nagyşlaryny tassyklady we GID1c-iň SAM-da pes derejelerde birmeňzeş beýan edilendigini görkezdi, GID1b bolsa SAM-yň daşynda has ýokary aňlatma görkezdi (Goşmaça 7d - l). PGID1b :: 2xmTQ2-GID1b terjime birleşmesi, şeýle hem SAM-nyň merkezinde pes ýa-da aňlatmadan başlap, organ serhetlerinde ýokary aňlatma çenli GID1b aňlatmanyň derejeli diapazonyny ýüze çykardy (Goşmaça 7m surat). Şeýlelik bilen, GID1 reseptorlary dokumalaryň arasynda we içinde birmeňzeş paýlanmaýar. Soňky synaglarda, GID1-iň (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) aşa aşa gysylmagynyň gipokotillerde qmRGA-nyň daşarky GA programmasyna duýgurlygyny ýokarlandyrandygyny gördük (3d surat, e). Munuň tersine, gipokotildäki qd17mRGA bilen ölçenen floresan GA3 bejergisine duýgur däldi (3f surat, g). Iki pikir üçin hem nahallar, GID1 reseptoryna baglamak ukybynyň güýçlendirilen ýa-da ýitirilen datçigiň çalt hereketine baha bermek üçin ýokary konsentrasiýa GA (100 μM GA3) bilen bejerildi. Bu netijeler bilelikde, qmRGA biosensorynyň GA we GA datçigi hökmünde birleşdirilen funksiýany ýerine ýetirýändigini tassyklaýar we GID1 reseptorynyň diferensial aňladylyşynyň datçigiň emissiýasyny ep-esli derejede modulirläp biljekdigini görkezýär.
Şu güne çenli SAM-da GA signallarynyň paýlanyşy näbelliligine galýar. Şol sebäpden, L1 gatlagyna (epidermis; 4a surat, b, usullara we goşmaça usullara serediň) GA signalizasiýa işjeňliginiň ýokary çözgütli mukdar kartalaryny hasaplamak üçin qmRGA aňladýan ösümlikleri we pCLV3 :: mCherry-NLS kök öýjük habarçysy35 ulandyk, sebäbi L1 SAM ösüşine gözegçilik etmekde möhüm rol oýnaýar36. Bu ýerde pCLV3 :: mCherry-NLS aňlatmasy GA signalizasiýa işjeňliginiň spatiotemporal paýlanyşyny seljermek üçin kesgitli geometrik salgylanma nokadyny üpjün etdi37. GA gapdal organlaryň ösmegi üçin möhüm hasaplansa-da, GA signallarynyň P3 basgançagyndan başlap (4a surat, b) pes bolandygyny gördük, ýaş P1 we P2 primordiumlaryň merkezi sebitdäki ýaly ortaça işjeňligi bardy (4a surat, b). GA-nyň has ýokary signalizasiýa işjeňligi, P1 / P2-den başlap (serhediň gyralarynda) we P4-den ýokary derejä, şeýle hem primordiýanyň arasynda ýerleşýän periferiýa sebitiniň ähli öýjüklerinde ýüze çykaryldy (4a surat, b we goşmaça surat 8a, b). Bu has ýokary GA duýduryş işjeňligi diňe epidermisde däl, L2 we ýokarky L3 gatlaklarynda-da syn edildi (Goşmaça 8b surat). SAM-da qmRGA ulanyp ýüze çykarylan GA signallarynyň nagşy hem wagtyň geçmegi bilen üýtgemedi (Goşmaça 8c - f, k). Qd17mRGA konstruksiýasy, jikme-jik häsiýetlendiren bäş sany garaşsyz çyzykdan T3 zawodlarynyň SAM-da yzygiderli düzgünleşdirilse-de, pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP konstruksiýasy bilen alnan floresan nagyşlaryny seljerip bildik (Goşmaça 8g - j, l). Bu gözegçilik setirinde SAM-da diňe floresan gatnaşygynda ownuk üýtgeşmeler ýüze çykaryldy, ýöne SAM merkezinde TagBFP bilen baglanyşykly VENUS-yň aýdyň we garaşylmadyk azalmagyny gördük. Bu, qmRGA tarapyndan syn edilýän signalizasiýa nagşynyň, mRGA-VENUS-yň GA bagly zaýalanmagyny görkezýändigini tassyklaýar, ýöne şeýle hem qmRGA-nyň meristem merkezinde GA signalizasiýa işine aşa baha berip biljekdigini görkezýär. Gysgaça aýdanymyzda, netijelerimiz esasan primordiýanyň paýlanyşyny görkezýän GA signalizasiýa görnüşini açýar. Primordial sebitiň (IPR) paýlanyşy ösýän primordium bilen merkezi sebitiň arasynda ýokary GA signalizasiýa işjeňliginiň kem-kemden döredilmegi bilen baglanyşykly, şol bir wagtyň özünde primordiumda GA signalizasiýa işjeňligi peselýär (4c-nji surat, d).
GID1b we GID1c reseptorlarynyň paýlanyşy (ýokarda serediň) GA reseptorlarynyň diferensial aňladylyşynyň SAM-da GA signalizasiýa işjeňliginiň görnüşini döretmäge kömek edýändigini görkezýär. GA-nyň diferensial toplanmagynyň bolup biljekdigi hakda pikir etdik. Bu mümkinçiligi derňemek üçin nlsGPS1 GA FRET datçigini ulandyk. 10 μM GA4 + 7 bilen 100 minutda bejerilen nlsGPS1 SAM-da işjeňleşdirme ýygylygynyň ýokarlanmagy ýüze çykaryldy (goşmaça surat 9a - e), bu nlsGPS1-iň kökdäki ýaly SAM-daky GA konsentrasiýasynyň üýtgemegine jogap berýändigini görkezýär21. NlsGPS1 işjeňleşdirme ýygylygynyň giňişlikde paýlanyşy, SAM-yň daşky gatlaklarynda GA derejesiniň pesdigini ýüze çykardy, ýöne SAM-nyň merkezinde we serhetlerinde ýokarlanandygyny görkezdi (4e-nji surat we goşmaça surat 9a, c). Bu, GA-nyň SAM-da qmRGA tarapyndan açylan bilen deňeşdirip boljak giňişlik nagşy bilen paýlanýandygyny görkezýär. Goşmaça çemeleşme hökmünde, SAM-a floresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ýa-da Fl bilen negatiw gözegçilik hökmünde bejerdik. Fl signaly pes intensiwlikde bolsa-da merkezi sebiti we primordiumy öz içine alýan SAM-da paýlandy (4j-nji surat we goşmaça 10d surat). Munuň tersine, GA-Fl-iň üçüsi hem primordium serhetlerinde we IPR-iň galan ýerlerinde dürli derejelerde ýygnandy, GA7-Fl IPR-iň iň uly domeninde jemlendi (4k surat we goşmaça surat 10a, b). Floresan intensiwliginiň mukdary, IP-IPR däl intensiwlik gatnaşygy GA-Fl bilen bejerilen SAM-da Fl bejergisi SAM bilen deňeşdirilende has ýokarydygyny görkezdi (4l surat we goşmaça 10c surat). Bu netijeler bilelikde GA-nyň organ serhedine iň ýakyn ýerde ýerleşýän IPR öýjüklerinde has ýokary konsentrasiýalarda bardygyny görkezýär. Bu, SAM GA signalizasiýa işjeňliginiň nusgasynyň GA reseptorlarynyň diferensial aňladylyşyndan we organ serhetleriniň golaýyndaky IPR öýjüklerinde GA-nyň diferensial toplanmagyndan gelip çykýandygyny görkezýär. Şeýlelik bilen, seljerişimiz GA signalynyň garaşylmadyk spatiotemporal görnüşini ýüze çykardy, SAM merkezinde we primordiumda has pes işjeňlik we periferiýa sebitindäki IPR-de has ýokary işjeňlik.
Differensial GA signalizasiýa işjeňliginiň SAM-daky roluna düşünmek üçin GA signalizasiýa işjeňliginiň, öýjükleriň giňelmeginiň we öýjük bölünişiginiň arasyndaky baglanyşygy seljerdik, SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Ösüşi kadalaşdyrmakda GA-nyň roluny göz öňünde tutup, öýjükleriň giňelmegi parametrleri bilen oňyn arabaglanyşyga garaşylýar. Şonuň üçin ilki bilen GA signalizasiýa işjeňlik kartalaryny öýjügiň üstki ösüş depginleriniň kartalary bilen (belli bir öýjük we bölünen gyz öýjükleri üçin öýjügiň giňelmeginiň güýji üçin proksi hökmünde) we öýjügiň giňelmegini kesgitleýän ösüş anizotropiýasy kartalary bilen deňeşdirdik (bu ýerde belli bir öýjük we bölünişikdäki gyz öýjükleri üçin hem ulanylýar; 5a surat, b, Usullar we goşmaça usullar). SAM öýjükleriniň üstki ösüş depgini kartalarymyz, serhetde iň az ösüş depgini we gülleriň ösmeginde iň ýokary ösüş depgini bilen öňki gözegçilikler 38,39 bilen gabat gelýär (5a surat). Esasy komponent derňewi (PCA) GA signalizasiýa işjeňliginiň öýjük üstüniň ösüş intensiwligi bilen negatiw arabaglanyşygyny görkezdi (5-nji surat). Şeýle hem, üýtgemegiň esasy oklarynyň, şol sanda GA signalizasiýa girişiniň we ösüş intensiwliginiň, ýokary analizlerde öýjükleriň SAM merkezinden çykarylmagyny tassyklaýan ýokary CLV3 aňlatmasy bilen kesgitlenen ugra gönüburçlydygyny görkezdik. Spearman korrelýasiýa seljermesi PCA netijelerini tassyklady (5d surat), IPR-de has ýokary GA signallarynyň öýjükleriň giňelmegine sebäp bolmaýandygyny görkezýär. Şeýle-de bolsa, korrelýasiýa seljermesi GA signalizasiýa işjeňligi bilen ösüş anizotropiýasynyň arasynda birneme oňyn arabaglanyşygy ýüze çykardy (5c surat, d), IPR-de has ýokary GA duýduryşynyň öýjükleriň ösüş ugruna we ähtimal öýjük bölüniş tekizliginiň ýagdaýyna täsir edýändigini görkezýär.
a, b SAM-da ortaça ýerüsti ösüşiň (a) we ösüş anizotropiýasynyň (b) ýylylyk kartalary ortaça ýedi garaşsyz ösümligiň (degişlilikde öýjükleriň giňelmeginiň güýji we ugry üçin wekil hökmünde ulanylýar). c PCA derňewinde aşakdaky üýtgeýjiler bar: GA signaly, ýerüsti ösüş intensiwligi, ýerüsti ösüş anizotropiýasy we CLV3 aňlatmasy. PCA komponenti 1 esasan ýerüsti ösüş intensiwligi bilen negatiw korrelýasiýa edildi we GA signaly bilen oňyn korrelýasiýa edildi. PCA 2-nji komponent, esasan, ýerüsti ösüş anizotropiýasy bilen oňyn korrelýasiýa edildi we CLV3 aňlatmasy bilen negatiw korrelýasiýa edildi. Göterimler her bir komponent bilen düşündirilýän üýtgemäni görkezýär. d GA signalynyň, ýerüsti ösüş intensiwliginiň we CZ-den başga dokumanyň masştabynda ýerüsti ösüş anizotropiýasynyň arasyndaky naýza korrelýasiýa derňewi. Sag tarapdaky san iki üýtgeýjiniň arasyndaky Spearman rho bahasydyr. Asterisks korrelýasiýa / otrisatel korrelýasiýanyň gaty ähmiýetli ýagdaýlaryny görkezýär. e Konokok mikroskopiýa arkaly Col-0 SAM L1 öýjüklerini 3D şekillendirmek. SAM-da (ýöne primordium däl) 10 sagatda emele gelen täze öýjük diwarlary burç bahalaryna görä reňklenýär. Reňk çyzgysy sagyň aşaky burçunda görkezilýär. Salgyda 0 sagatda degişli 3D şekili görkezilýär. Synag şuňa meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy. f Box gutujyklary IPR we IPR däl Col-0 SAM-da öýjükleriň bölüniş derejesini görkezýär (n = 10 garaşsyz ösümlik). Merkezi çyzyk ortaça görkezýär, guty araçäkleri 25-nji we 75-nji göterimleri görkezýär. Pyşyrdyklar R programma üpjünçiligi bilen kesgitlenen iň pes we iň ýokary bahalary görkezýär. P bahalary Welçiň iki guýrukly t-synagy bilen alyndy. g, h SAM merkezinden (ak nokatly çyzyk) (diňe ýiti burç bahalary, ýagny 0–90 ° göz öňünde tutulýar) we (h) meristemiň içindäki aýlaw / gapdal we radial ugurlar boýunça täze öýjük diwarynyň (magenta) burçuny nädip ölçemelidigini görkezýän shematiki diagramma. i SAM (goýy gök), IPR (orta gök) we IPR däl (açyk gök) boýunça öýjük bölüniş tekizliginiň ugry ýygylyk gistogrammalary. P bahalary iki guýrukly Kolmogorow-Smirnow synagy arkaly alyndy. Synag şuňa meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy. j IPR-iň P3 (açyk ýaşyl), P4 (orta ýaşyl) we P5 (goýy ýaşyl) töwereginde IPR-iň öýjük bölüniş tekizliginiň ugry ýygylygy. P bahalary iki guýrukly Kolmogorow-Smirnow synagy arkaly alyndy. Synag şuňa meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy.
Şonuň üçin, indiki synag wagtynda täze döredilen öýjük diwarlaryny kesgitlemek bilen GA signalizasiýasy bilen öýjük bölüniş işjeňliginiň arasyndaky baglanyşygy derňedik (5e-nji surat). Bu çemeleşme, öýjük bölünişiniň ýygylygyny we ugruny ölçemäge mümkinçilik berdi. Geň galdyryjy zat, IPR-de we beýleki SAM-da öýjük bölünişleriniň ýygylygynyň (IPR däl, 5f surat) meňzeşdigini, IPR bilen IPR däl öýjükleriň arasyndaky GA duýduryşynyň tapawudynyň öýjük bölünişine ep-esli täsir etmeýändigini gördük. Bu we GA signalizasiýasy bilen ösüş anizotropiýasynyň arasyndaky oňyn arabaglanyşyk, GA signalizasiýa işjeňliginiň öýjük bölüniş tekizliginiň ugruna täsir edip biljekdigini ýa-da ýokdugyny gözden geçirmäge mejbur etdi. Täze öýjük diwarynyň meristem merkezini we täze öýjük diwarynyň merkezini birleşdirýän radial ok bilen deňeşdirilende ýiti burç hökmünde ölçedik (5e-i surat) we öýjükleriň radial okuna görä 90 ° töweregi burçlarda bölünmeginiň aýdyň tendensiýasyny gördük, iň ýokary ýygylyklar 70–80 ° (23.28%) we 80–90 ° (22-nji surat). 5s). GA duýduryşynyň bu öýjük bölünişiniň özüni alyp barşyna goşandyny öwrenmek üçin IPR we IPR däl öýjük bölüniş parametrlerini aýratyn seljerdik (5i-nji surat). IPR öýjüklerinde bölüniş burç paýlanyşynyň IPR däl öýjüklerde ýa-da tutuş SAM öýjüklerinde tapawudynyň bardygyny gördük, IPR öýjükleri gapdal / tegelek öýjük bölünişleriniň has köp bölegini görkezýär, ýagny degişlilikde 70–80 ° we 80–90 ° (degişlilikde 33.86% we 30,71%) (5i-nji surat). Şeýlelik bilen, gözegçiliklerimiz, GA signalizasiýa işjeňliginiň we ösüş anizotropiýasynyň arasyndaky korrelýasiýa meňzeş, ýokary GA signalizasiýasy bilen öýjük bölüniş tekizligi ugrunyň arasyndaky baglanyşygy ýüze çykardy (5-nji surat, d). Bu birleşigiň giňişlikde goralmagyny has-da berkitmek üçin, P3-den başlap, primordiýany gurşap alýan IPR öýjüklerinde bölüniş tekizliginiň ugruny ölçedik, sebäbi bu sebitde iň ýokary GA signalizasiýa işjeňligi P4-den başlap (4-nji surat). IPR-iň P3 we P4 töweregindäki bölüniş burçlary statistik taýdan möhüm tapawudy görkezmedi, ýogsa P4 töweregindäki IPR-de gapdal öýjük bölünişleriniň ýygylygy köpeldi (5j-nji surat). Şeýle-de bolsa, P5 töweregindäki IPR öýjüklerinde, öýjük bölüniş tekizliginiň ugrunyň tapawudy statistiki ähmiýete eýe bolup, transvers öýjük bölünişleriniň ýygylygynyň ep-esli ýokarlanmagy bilen (5j-nji surat). Bu netijeler bilelikde GA signalynyň SAM-da öýjük bölünişleriniň ugruny dolandyryp biljekdigini görkezýär, bu bolsa ýokary GA duýduryşynyň IPR-de öýjük bölünişiginiň gapdal ugruna sebäp bolup biljekdigi baradaky öňki habarlara laýyk gelýän 40,41.
IPR-de öýjükleriň primordiýa däl-de, internodlara goşuljakdygy çaklanylýar2,42,43. IPR-de öýjük bölünişikleriniň transvers ugry, internodlarda epidermal öýjükleriň paralel uzyn hatarlarynyň adaty guralyşyna sebäp bolup biler. Aboveokarda beýan edilen gözegçiliklerimiz, GA bölünişiginiň öýjük bölünişiniň ugruny kadalaşdyrmak arkaly bu prosesde möhüm rol oýnaýandygyny görkezýär.
Birnäçe DELLA geniniň işleýşiniň ýitmegi, esaslandyryjy GA seslenmesine getirýär we bu çaklamany barlamak üçin della mutantlary ulanylyp bilner44. Ilki bilen SAM-da bäş sany DELLA geniniň aňlatma nagyşlaryny analiz etdik. GUS setiriniň transkripsiýa birleşmesi GAI, RGA, RGL1 we RGL2 (has az derejede) SAM-da beýan edilendigini görkezdi (Goşmaça 11a - d). Situ gibridizasiýasy GAI mRNA-nyň esasan primordiýada we ösýän güllerde ýygnanýandygyny görkezdi (Goşmaça 11e surat). RGL1 we RGL3 mRNA SAM örtüginde we köne güllerde ýüze çykaryldy, RGL2 mRNA serhetýaka sebitde has köpdi (Goşmaça 11f - sag). PRGL3 :: Konfokal şekillendiriş :: RGL3-GFP SAM situ gibridizasiýasynda görkezilen aňlatmany tassyklady we RGL3 belogynyň SAM-nyň merkezi böleginde ýygnanýandygyny görkezdi (Goşmaça 11i surat). PRGA :: GFP-RGA çyzygyny ulanyp, RGA belogynyň SAM-da ýygnanýandygyny gördük, ýöne bollygy P4-den başlap serhetde azalýar (Goşmaça 11j surat). Reri gelende aýtsak, RGL3 we RGA aňlatma nagyşlary, qmRGA tarapyndan kesgitlenişi ýaly IPR-de has ýokary GA signalizasiýa işjeňligine laýyk gelýär (4-nji surat). Mundan başga-da, bu maglumatlar ähli DELLA-laryň SAM-da aňladylandygyny we aňlatmalarynyň tutuş SAM-y öz içine alýandygyny görkezýär.
Soňra ýabany görnüşli SAM (Ler, gözegçilik) we gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della kwintuple (global) mutantlarda öýjük bölünişiniň parametrlerini seljerdik (6a surat, b). Gyzykly tarapy, della global mutant SAM-da ýabany görnüş bilen deňeşdirilende öýjük bölüniş burç ýygylyklarynyň paýlanyşynda statistik taýdan möhüm üýtgeşmäni gördük (6-njy surat). Della global mutantynyň bu üýtgemegi, 80–90 ° burçlaryň (34,71% 24.55%) we has az derejede 70–80 ° burçlaryň (23.78% 20.18%), ýagny transvers öýjük bölünişlerine laýyk gelmeginiň sebäbi boldy (6-njy surat). Transla däl bölünişleriň ýygylygy (0–60 °) della global mutantda-da pesdi (6-njy surat). Della global mutantyň SAM-da transvers öýjük bölünişleriniň ýygylygy ep-esli ýokarlandy (6b surat). IPR-de transvers öýjük bölünişleriniň ýygylygy della global mutantda ýabany görnüş bilen deňeşdirilende has ýokarydy (6-njy surat). IPR sebitiniň daşynda ýabany görnüş öýjük bölüniş burçlarynyň birmeňzeş paýlanyşyna eýe boldy, della global mutant bolsa IPR ýaly tangensial bölünişikleri makul bildi (6e surat). Şeýle hem, GA-nyň ýygnanýan GA-hereketsiz mutant fonunda ga2 oksidaza (ga2ox) dörtburç mutantlaryň (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 we ga2ox6-2) öýjük bölünişleriniň ugruny kesgitledik. GA derejesiniň ýokarlanmagy bilen yzygiderli, dört sany ga2ox mutant infloresensiýanyň SAM-y Col-0-dan has ulydy (goşmaça surat 12a, b) we Col-0 bilen deňeşdirilende, ga2ox SAM öýjük bölüniş burçlarynyň düýpgöter tapawutly paýlanyşyny görkezdi, burç ýygylygy 50 ° -dan 90 ° -e çenli ýokarlandy, ýagny ýene-de goşmaça goşundylar. Şeýlelik bilen, GA duýduryşynyň we GA ýygnamagynyň esaslandyryjy işjeňleşdirilmegi IPR-de we SAM-nyň galan böleklerinde bölünişiklere sebäp bolýandygyny görkezýäris.
a, b PI reňkli Ler (a) we global della mutant (b) SAM-yň L1 gatlagyny konokok mikroskopiýa arkaly 3D şekillendirmek. 10 sagadyň dowamynda SAM-da emele gelen täze öýjük diwarlary burç bahalaryna görä görkezilýär we reňklenýär. Salgyda SAM 0 sagatda görkezilýär. Reňk çyzgysy sagyň aşaky burçunda görkezilýär. (B) içindäki ok, global della mutantynda deňleşdirilen öýjük faýllarynyň mysalyny görkezýär. Synag şuňa meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy. Ler we global dellanyň arasynda tutuş SAM (d), IPR (e) we IPR däl (f) öýjük bölüniş tekizlik ugurlarynyň ýygylyk paýlanyşyny deňeşdirmek. P bahalary iki guýrukly Kolmogorow-Smirnow synagyndan peýdalanyp alyndy. f, g Col-0 (i) we pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgen ösümlikleriniň PI reňkli SAM-yň konokok şekillerini 3D şekillendirmek. Paneller (a, b) SAM-da 10 sagadyň içinde emele gelen täze öýjük diwarlaryny görkezýär (ýöne primordia däl). Synag şuňa meňzeş netijeler bilen iki gezek gaýtalandy. h - j Col-0 we pCUC2 :: gai-1-VENUS ösümlikleriniň arasynda tutuş SAM (h), IPR (i) we IPR däl (j) ýerleşýän öýjük bölüniş tekizlik ugurlarynyň ýygylyk paýlanyşyny deňeşdirmek. P bahalary iki guýrukly Kolmogorow - Smirnow synagyndan peýdalanyp alyndy.
Soňra, IPR-de GA signalyny saklamagyň täsirini barladyk. Bu maksat bilen, VENUS-a (pCUC2 :: gai-1-VENUS setirinde) birleşdirilen negatiw gai-1 belogynyň aňladylyşyny üpjün etmek üçin kotiledon kubogy 2 (CUC2) promouterini ulandyk. Wildabany görnüşli SAM-da, CUC2 öňe süriji, P4-den başlap serhet öýjüklerini goşmak bilen SAM-daky IPR-leriň köpüsini görkezýär we şuňa meňzeş aýratyn aňlatma pCUC2 :: gai-1-VENUS ösümliklerinde (aşaga serediň). Öýjük bölüniş burçlarynyň pCUC2 :: gai-1-VENUS ösümlikleriniň SAM ýa-da IPR boýunça paýlanyşy ýabany görnüşden düýpgöter tapawutly däldi, ýöne garaşylmadyk ýagdaýda bu ösümliklerde IPR ýok öýjükleriň has ýokary ýygylykda 80–90 ° bölünendigini gördük (6f - j).
Öýjük bölünişiniň ugrunyň SAM-nyň geometriýasyna, hususan-da dokumanyň egriligi netijesinde döreýän dartyş stresine baglydygy öňe sürüldi. Şonuň üçin della global mutant we pCUC2 :: gai-1-VENUS ösümliklerinde SAM görnüşiniň üýtgedilendigini ýa-da ýokdugyny soradyk. Öň habar berlişi ýaly, della global mutant SAM-yň ululygy ýabany görnüşden has uludy (Goşmaça 13a surat, b, d). CLV3 we STM RNA-nyň situ gibridizasiýasy della mutantlarynda meristemiň giňelmegini tassyklady we kök öýjük ýeriniň gapdal giňelmegini görkezdi (Goşmaça 13e, f, h, i). Şeýle-de bolsa, SAM egriligi iki genotipde-de meňzeýärdi (Goşmaça surat 13k, m, n, p). Gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dörtburç mutantda ýabany görnüş bilen deňeşdirilende egrilik üýtgemezden ululygynyň şuňa meňzeş artandygyny gördük (13-nji surat, d, g, j, l, o, p). Öýjük bölünişiniň ýygylygy della dörtburç mutantda-da täsir etdi, ýöne della monolit mutantyna garanyňda az derejede (Goşmaça 12d - f). Bu doza täsiri, egrilik täsiriniň ýoklugy bilen birlikde, Della dörtburç mutantdaky galyndy RGL3 işjeňliginiň, DELLA işjeňliginiň ýitmegi sebäpli öýjük bölüniş ugrunyň üýtgemegini we SAM geometriýasynyň üýtgemegine däl-de, GA signalizasiýa işjeňliginiň üýtgemegine jogap bolup biljekdigini görkezýär. Aboveokarda görkezilişi ýaly, CUC2 promouter S4-de IPR aňlatmasyny P4-den başlaýar (Goşmaça 14a, b), tersine, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM kiçeldi, ýöne egriligi has ýokarydy (Goşmaça 14c - h). PCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morfologiýasyndaky bu üýtgeşiklik, ýokary aýlawly stresler SAM merkezinden has gysga aralykda başlaýan ýabany görnüş bilen deňeşdirilende mehaniki stresleriň başgaça paýlanmagyna sebäp bolup biler. Ativea-da bolmasa, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morfologiýasyndaky üýtgeşmeler, transgeni aňlatmagyň netijesinde ýüze çykan sebit mehaniki häsiýetleriniň üýtgemeginden bolup biler48. Iki ýagdaýda-da, gözegçiliklerimizi düşündirip, öýjükleriň aýlaw / transvers ugurda bölünmek ähtimallygyny ýokarlandyryp, GA signalynyň üýtgemeleriniň täsirini bölekleýin öwezini dolup biler.
Maglumatlarymyz bilelikde alnanda, has ýokary GA duýduryşynyň IPR-de öýjük bölüniş tekizliginiň gapdal ugrunda işjeň rol oýnaýandygyny tassyklaýar. Şeýle hem, meristemiň egriliginiň IPR-de öýjük bölüniş tekizliginiň ugruna täsir edýändigini görkezýär.
GA signalizasiýa işjeňligi sebäpli bölüniş tekizliginiň IPR-de transvers ugry, epidermal internodda tapyljak öýjükli guramany kesgitlemek üçin GA-nyň SAM-daky epidermisde radial öýjük faýlyny öňünden guraýandygyny görkezýär. Hakykatdanam, şeýle öýjükli faýllar della global mutantlaryň SAM şekillerinde ýygy-ýygydan görünýärdi (6b surat). Şeýlelik bilen, SAM-da GA signalynyň giňişlik nagşynyň ösüş funksiýasyny has giňişleýin öwrenmek üçin IPR-de ýabany görnüşli (Ler we Col-0), della global mutantlary we pCUC2 :: gai-1-VENUS transgen ösümliklerinde giňişlikdäki guralyşyny seljermek üçin wagtlaýyn şekillendiriş usulyny ulandyk.
QmRGA-nyň IPR-de GA signalizasiýa işjeňliginiň P1 / P2-den ýokarlanandygyny we P4-de iň ýokary derejä ýetendigini we bu nagşyň wagtyň geçmegi bilen hemişelik bolandygyny görkezdi (4a - f we goşmaça surat 8c - f, k). GA signalynyň ýokarlanmagy bilen IPR-de öýjükleriň giňişlikdäki guralyşyny seljermek üçin, Ler IPR öýjüklerini ýokarda we P4-iň gyralarynda bellik etdik, olaryň ösüş ykbalyna görä ilkinji synlamadan soň 34 sagadyň dowamynda seljerildi, ýagny iki gezekden gowrak plastid döwür, P1 / P2-den P4-e çenli başlangyç ösüş döwründe IPR öýjüklerini yzarlamaga mümkinçilik berýär. Üç dürli reňk ulandyk: P4-iň golaýyndaky primordiuma birleşdirilen öýjükler üçin sary, IPR-de bolanlar üçin ýaşyl we iki prosese gatnaşanlar üçin gyrmyzy (7a - c). T0 (0 sagatda) P4-iň öňünde 1-2 gatlak IPR öýjükleri görünýärdi (7a surat). Garaşylyşy ýaly, bu öýjükler bölünende, esasan transvers bölüniş tekizliginiň üsti bilen amala aşyryldy (7a - c). Şuňa meňzeş netijeler Col-0 SAM (serhetdäki Lerdäki P4 bilen meňzeş P3-e gönükdirilen) ulanylyp alyndy, ýöne bu genotipde gül serhedinde emele gelen epler IPR öýjüklerini has çalt gizledi (7g - i surat). Şeýlelik bilen, IPR öýjükleriniň bölüniş nagşy, öýjükleri internodlardaky ýaly radial hatarlara öňünden tertipleýär. Radial hatarlaryň gurulmagy we yzygiderli organlaryň arasynda IPR öýjükleriniň lokalizasiýasy bu öýjükleriň internodal nesillerdigini görkezýär.
Bu ýerde, endogen signalizasiýa ýollaryna päsgelçiligi azaldyp, öýjük derejesinde GA funksiýasy barada maglumat berýän GA we GA reseptor konsentrasiýalarynyň netijesinde GA signalizasiýa işjeňligini mukdar taýdan kartalaşdyrmaga mümkinçilik berýän ratiometrik GA signal beriji biosensor, qmRGA taýýarladyk. Bu maksat bilen, DELLA täsirleşýän hyzmatdaşlary baglanyşdyrmak ukybyny ýitiren, ýöne GA bilen döredilen proteolizlere duýgur bolan üýtgedilen DELLA belogyny, mRGA gurduk. qmRGA GA derejesindäki ekzogen we endogen üýtgeşmelere jogap berýär we dinamiki duýgurlyk häsiýetleri ösüş döwründe GA signalizasiýa işjeňliginiň spatiotemporal üýtgemelerine baha bermäge mümkinçilik berýär. qmRGA şeýle hem örän çeýe guraldyr, sebäbi aňlatmak üçin ulanylýan promouteri üýtgedip (zerur bolsa) dürli dokumalara uýgunlaşdyrylyp bilner, we GA signalizasiýa ýolunyň konserwirlenen tebigatyny we angiospermleriň üstünden PFYRE sebäbini göz öňünde tutup, beýleki görnüşlere geçip biler22. Şonuň bilen birlikde, tüwi SLR1 DELLA belogynda (HYY497AAA) ekwiwalent mutasiýa SLR1-iň ösüş repressor işjeňligini basyp ýatyrmak üçin görkezildi, şol bir wagtyň özünde mRGA23 meňzeş GA-nyň aralaşmagyny azaldýar. Aberi gelende aýtsak, Arabidopsisde geçirilen soňky gözlegler PFYRE domeninde (S474L) bir aminokislotanyň mutasiýa, transkripsiýa faktorlary hyzmatdaşlary bilen täsirleşmek ukybyna täsir etmezden RGA-nyň transkripsiýa işjeňligini üýtgedendigini görkezdi50. Bu mutasiýa mRGA-da bar bolan 3 aminokislotanyň ornuna gaty ýakyn bolsa-da, gözleglerimiz bu iki mutasiýa DELLA-nyň tapawutly aýratynlyklaryny üýtgedýändigini görkezýär. Transkripsiýa faktorlarynyň köpüsiniň DELLA26,51 LHR1 we SAW domenleri bilen baglanyşýandygyna garamazdan, PFYRE domenindäki käbir konserwirlenen aminokislotalar bu täsirleri durnuklaşdyrmaga kömek edip biler.
Internode ösüşi ösümlik arhitekturasynda we hasyllylygy ýokarlandyrmakda esasy aýratynlykdyr. qmRGA IPR internode progenitor öýjüklerinde has ýokary GA signalizasiýa işjeňligini ýüze çykardy. San taýdan şekillendiriş we genetikany birleşdirip, GA signalizasiýa nagyşlarynyň SAM epidermisinde tegelek / transvers öýjük bölüniş uçarlarynyň üstünden geçýändigini, internodyň ösmegi üçin zerur bolan öýjük bölüniş guramasyny emele getirýändigini görkezdik. Ösüş döwründe öýjük bölüniş tekizliginiň ugruny birnäçe sazlaýjy kesgitlenildi52,53. Biziň işimiz, GA signalizasiýa işjeňliginiň bu öýjükli parametrini nädip kadalaşdyrýandygyny aýdyň görkezýär. DELLA prefolding belok toplumlary bilen täsirleşip biler41, şonuň üçin GA duýduryşy kortikal mikrotubula ugruna gönüden-göni täsir edip öýjük bölüniş tekizligini ugrukdyryp biler40,41,54,55. SAM-da has ýokary GA signalizasiýa işjeňliginiň korrelýasiýanyň öýjükleriň uzalmagy ýa-da bölünmegi däldigini, diňe GA-nyň IPR-de öýjük bölünişiniň ugruna gönüden-göni täsirine laýyk gelýän ösüş anizotropiýasydygyny görkezdik. Şeýle-de bolsa, bu täsiriň gytaklaýyn bolup biljekdigini hem aradan aýyryp bilmeris, mysal üçin GA bilen örtülen öýjük diwarynyň ýumşadylmagy bilen araçylyk edilýär56. Öýjük diwar häsiýetleriniň üýtgemegi mehaniki stres döredýär 57,58, bu hem kortikal mikrotubulalaryň ugruna täsir edip, öýjük bölüniş tekizliginiň ugruna täsir edip biler39,46,59. GA bilen döredilen mehaniki stresiň we GA tarapyndan mikrotubula ugrukdyrylyşynyň bilelikdäki täsiri, internodlary kesgitlemek üçin IPR-de öýjük bölünişiniň belli bir nusgasyny döretmäge gatnaşyp biler we bu pikiri barlamak üçin goşmaça barlaglar zerurdyr. Edil şonuň ýaly-da, öňki barlaglar DELLA-özara täsir edýän TCP14 we 15 beloklaryň internodyň emele gelmegine gözegçilik etmekdäki ähmiýetini görkezdi60,61 we bu faktorlar GA-nyň işini interode ösüşini kadalaşdyrýan BREVIPEDICELLUS (BP) we PENNYWISE (PNY) bilen ara alyp biler we GA signalyna täsir edýär. DELLA-laryň 63,64 signalizasiýa ýollarynyň brassinosteroid, etilen, jasmon kislotasy we abssis kislotasy (ABA) bilen täsirleşýändigini we bu gormonlaryň mikrotubula ugrukdyrylyşyna täsir edip biljekdigini göz öňünde tutup, GA-nyň öýjük bölünişine edýän täsiri beýleki gormonlar bilen araçylyk edip biler.
Irki sitologiki gözlegler, “Arabidopsis SAM” -yň içki we daşarky sebitleriniň internodyň ösüşi üçin zerurdygyny görkezdi2,42. GA-nyň içki dokumalarda öýjük bölünişigini işjeň tertipleşdirmegi12, SAM-da meristem we internod ululygyny kadalaşdyrmakda GA-nyň goşa funksiýasyny goldaýar. Öýjükli bölünişiň görnüşi içerki SAM dokumasynda hem berk düzgünleşdirilýär we bu kada köküň ösmegi üçin zerurdyr52. GA-nyň içerki SAM guramasynda öýjük bölüniş tekizligini ugrukdyrmakda, şeýlelik bilen SAM-daky internodlaryň spesifikasiýasyny we ösüşini sinhronlamakda rol oýnaýandygyny ýa-da ýokdugyny öwrenmek gyzykly bolar.
Ösümlikler toprakda in vitro ýa-da adaty ýagtylykda (16 sagat ýagtylyk, 22 ° C) 1% sukroz we 1% agar (Sigma) bilen doldurylan 1x Murashige-Skoog (MS) orta (Duchefa) ösdürilip ýetişdirildi, gipokotil we kök ösümligi synaglaryndan başga, hemişelik ýagtylyk we 22 ° C astynda dik tabaklarda nahallar ösdürilip ýetişdirildi. Nitrat synaglary üçin ösümlikler uzak möhletli şertlerde ýeterlik nitrat (0 ýa-da 10 mM KNO3), 0,5 m NH4-suksinat, 1% sukroz we 1% A-agar (Sigma) bilen üýtgedilen MS orta (bioWORLD ösümlik serişdesi) ösdürilip ýetişdirildi.
PDONR221-e girizilen GID1a cDNA pUBQ10 :: GID1a-mCherry öndürmek üçin pDONR P4-P1R-pUBQ10 we pDONR P2R-P3-mCherry bilen pB7m34GW birleşdirildi. PDONR221-e salnan IDD2 DNK p35S: IDD2-RFP öndürmek üçin pB7RWG266-a birleşdirildi. PGID1b :: 2xmTQ2-GID1b öndürmek üçin, GID1b kodlaýyş sebtiniň ýokarky akymynda 3,9 kb bölek we GID1b cDNA (1,3 kb) we terminator (3,4 kb) bolan 4,7 kb bölek ilki goşmaça tablisadaky primerleri ulanyp güýçlendirildi we soňra pDONR P4R P2R-P3 (Termo Fisher Scientific) degişlilikde we şlýuz klonirlemesini ulanyp pGreen 012567 maksat wektoryna pDONR221 2xmTQ268 bilen birleşdirildi. PCUC2 :: LSSmOrange döretmek üçin, CUC2 öňe süriji yzygiderliligi (ATG-den 3229 bp ýokary akym), soň bolsa N7 ýadro lokalizasiýa signaly we NOS transkripsiýa terminaly, şlýuz 3-bölek rekombinasiýasy bilen pGreen kanamisin nyşana alýan wektoryna kodlaşdyryldy. Ösümlik ikilik wektory, Agrobacterium tumefaciens ştammy GV3101 bilen girizildi we degişlilikde Agrobacterium infiltrasiýa usuly bilen Nikotiana benthamiana ýapraklaryna we gül çökdürmek usuly bilen Arabidopsis thaliana Col-0 girizildi. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry we pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA degişlilikde degişli haçlaryň F3 we F1 nesillerinden izolirlendi.
Situ gibridizasiýasyndaky RNK takmynan 1 sm uzynlykdaky atyş maslahatlarynda ýerine ýetirildi, ýygnalyp, derrew FAA erginine (3,7% formaldegid, 5% sirke kislotasy, 50% etanol) 4 ° C-e çenli sowadyldy. 2 × 15 minut wakuum bejergisinden soň, düzediji üýtgedildi we nusgalar bir gije inkubasiýa edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, we RGL3 cDNA-lary we 3′-UTR-laryna garşy antisense zondlary Rosier we al.73 tarapyndan görkezilişi ýaly Goşmaça 3-nji tablisada görkezilen primerler arkaly sintez edildi. Digoksigenin belgili zondlar, digoksigenin antikorlaryny (3000 esse eritme; Roçe, katalog belgisi: 11 093 274 910) immunodetizasiýa edildi we bölümlere 5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfat (BCIP, 250 esse eritme) / nitroblýu tetrazolium (NBT ergin)
Iş wagty: 10-2025-nji fewral