Sosna nematody, sosna tokaý ekosistemalarynda agyr ykdysady ýitgilere sebäp bolýan karantin göçýän endoparazitdir. Häzirki gözleg, sosna nematodlaryna garşy galogen indollaryň nematidiki işjeňligini we olaryň hereket mehanizmini gözden geçirýär. Sosna nematodlaryna garşy 5-ýodoindol we awermektin (polo positiveitel gözegçilik) nematisid çäreleri meňzeşdi we pes konsentrasiýalarda (10 μg / mL) ýokarydy. 5-ýodindol arassalygy, köpeliş işjeňligini, düwünçejik we gurçuk ölümini we lokomotiw hereketini peseltdi. Baglaryň oňurgasyzlara mahsus glutamat bilen örtülen hlorid kanal reseptorlary bilen molekulýar täsiri, awermektin ýaly 5-ýodindolyň reseptorlaryň işjeň ýeri bilen berk baglanyşýandygy baradaky düşünjäni goldaýar. 5-Iodoindole nematodlarda dürli fenotip deformasiýalara sebäp boldy, şol sanda organlaryň kadaly çökmegi / gysylmagy we wakuolizasiýanyň ýokarlanmagy. Bu netijeler wakuollaryň nematod metilasiýa bilen baglanyşykly ölüminde rol oýnap biljekdigini görkezýär. Möhümi, 5 ýodoindol ösümlikleriň ikisine-de (kelem we turp) zäherli däldi. Şeýlelik bilen, bu gözleg daşky gurşaw şertlerinde ýodindolyň ulanylmagynyň sosna süýümleriniň şikeslenmegine gözegçilik edip biljekdigini görkezýär.
Sosna agaç nematody (Bursaphelenchus ksilofilus) sosna tokaý nematodlaryna (PWN), sosna tokaý ekosistemalaryna agyr ekologiki zeper ýetirýändigi belli bolan göçüp barýan endoparazit nematodlara degişlidir1. Sosna agaç nematodynyň netijesinde dörän sosna keseli (PWD) Aziýa we Europeewropa ýaly birnäçe yklymda çynlakaý meselä öwrülýär we Demirgazyk Amerikada nematod sosna görnüşlerini ýok edýär1,2. Sosna agajynyň pese gaçmagy esasy ykdysady mesele we onuň global ýaýramagy umyt döredýär3. Aşakdaky sosna görnüşlerine köplenç nematod hüjüm edýär: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii we Pinus radiata4. Sosna nematody ýokançlykdan birnäçe hepde ýa-da birnäçe aýyň içinde sosna agaçlaryny öldürip bilýän çynlakaý keseldir. Mundan başga-da, sosna nematodyň ýaýramagy dürli ekosistemalarda köp bolýar, şonuň üçin dowamly ýokanç zynjyrlary döredildi1.
Bursaphelenchus ksilophilus, köp maşgalaly Aphelenchoidea we 102.5 klada degişli karantin ösümlik-parazit nematodydyr. Nematod kömelekler bilen iýmitlenýär we sosna agaçlarynyň agaç dokumalarynda köpelýär we dört dürli gurçuk basgançagyna öwrülýär: L1, L2, L3, L4 we uly ýaşly adam1,6. Iýmit ýetmezçiligi şertlerinde sosna nematody ýöriteleşdirilen gurçuk basgançagyna geçýär - wektoryny parazitleýän sosna gabygy tomzagy (Monochamus alternatus) we sagdyn sosna agaçlaryna geçirilýär. Sagdyn öý eýelerinde nematodlar ösümlik dokumalarynyň üsti bilen çalt göçýärler we parenhimat öýjükleri bilen iýmitlenýärler, bu infeksiýadan soň bir ýylyň içinde birnäçe duýgurlyk reaksiýalaryna, sosna süpürilmegine we ölüme sebäp bolýar1,7,8.
Sosna nematodlaryna biologiki gözegçilik 20-nji asyra degişli karantin çäreleri bilen köpden bäri kyn bolup gelýär. Sosna nematodlaryna gözegçilik etmek üçin häzirki strategiýalar, esasan, agaç tüssesi we nematisidleri agaç şahalaryna ýerleşdirmek ýaly himiki bejergileri öz içine alýar. Iň köp ulanylýan nematisidler, awermektin maşgalasyna degişli awermektin we awermektin benzoatdyr. Bu gymmat himiki maddalar köp nematod görnüşlerine garşy örän täsirli we ekologiýa taýdan howpsuz hasaplanýar9. Şeýle-de bolsa, bu nematisidleri yzygiderli ulanmak, Leptinotarsa Decemlineata, Plutella ksilostella we nematodlar Trihostrongylus colubriformis we Ostertagia sirkinta10, 11-e garşy durnuksyz ösýän sosna nematodlarynyň döremegine eltip biljek saýlama basyşyny döreder diýlip garaşylýar. Şonuň üçin garşylyk nusgalaryny yzygiderli öwrenmeli we PWD-e gözegçilik etmek üçin alternatiw, tygşytly we ekologiýa taýdan arassa çäreleri tapmak üçin nematisidler yzygiderli barlanmalydyr. Soňky onýyllyklaryň dowamynda birnäçe ýazyjy ösümlik ekstraktlaryny, efir ýaglaryny we uçgunlary nematod gözegçilik serişdesi hökmünde ulanmagy teklip etdi13,14,15,16.
Recentlyakynda Caenorhabditis elegans 17-de, öýjükli we birek-birege signal berýän molekulanyň indolyň nematisid işjeňligini görkezdik. Indole mikrob ekologiýasynda giňden ýaýran öýjükli signal bolup, mikrob fiziologiýasyna, sporanyň emele gelmegine, plazmid durnuklylygyna, neşe garşylygy, biofilmiň emele gelmegi we wirus 18, 19-a täsir edýän köp sanly funksiýa gözegçilik edýär. Indolyň we olardan emele gelenleriň beýleki patogen nematodlara garşy işjeňligi öwrenilmedi. Bu gözlegimizde, sosna nematodlaryna garşy 34 indoluň nematisid işjeňligini derňedik we mikroskopiýa, wagtyň geçmegi bilen surata düşürmek we molekulýar doklama synaglaryny ulanyp, iň güýçli 5-ýodindolyň hereket mehanizmini düşündirdik we tohumyň gögeriş barlagyny ulanyp ösümliklere zäherli täsirlerine baha berdik.
Odeokary konsentrasiýalaryň (> 1,0 mM) öň nematodlara nematisid täsir edýändigi habar berildi17. B. ksilofiliň (garyşyk durmuş etaplary) 1 mM-de indol ýa-da 33 dürli indol emele gelen bejergiden soň, B. ksilofiliň ölümi gözegçilik we bejeriş toparlarynda diri we ölen nematodlary sanamak bilen ölçenildi. Bäş indol möhüm nematisid işjeňligini görkezdi; bejerilmedik gözegçilik toparynyň diri galmagy 24 sagatdan soň 95 ± 7% boldy. Synagdan geçirilen 34 indoldan 5 m-ýodoindol we 4 m-lik florindol 100% ölüme sebäp boldy, 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat we 7-ýodoindol takmynan 50% ölüme sebäp boldy (1-nji tablisa).
5-ýodoindolyň wakuol emele gelmegine we sosna agaç nematodynyň alyş-çalşyna täsiri. : Gyzyl oklar wakuollaryň çişmegini, gök oklar wakuollaryň birleşmegini görkezýär, gara oklar bolsa uly wakuollary görkezýär. Tereziniň çyzgysy = 50 μm.
Mundan başga-da, bu gözleg sosna nematodlarynda metan bilen örtülen ölümiň yzygiderli prosesini beýan etdi (4C-nji surat). Metanogen ölüm, belli sitoplazmatiki wakuollaryň toplanmagy bilen baglanyşykly öýjük ölüminiň apoptotik däl görnüşidir27. Sosna nematodlarynda görlen morfologiki kemçilikler, metanyň ölümi mehanizmi bilen ýakyndan baglanyşykly bolup görünýär. Dürli döwürlerde mikroskopiki gözleg, 5 ýodoindola (0,1 mM) 20 sagat täsir edenden soň ullakan vakuollaryň emele gelendigini görkezdi. Mikroskopiki vakuollar 8 sagadyň bejergisinden soň syn edildi we olaryň sany 12 sagatdan soň köpeldi. Birnäçe uly wakuol 14 sagatdan soň syn edildi. Birnäçe birleşdirilen vakuollar 12-16 sagadyň dowamynda bejergiden soň aýdyň görünýärdi, bu wakuol birleşmesiniň metanogen ölüm mehanizminiň esasyny düzýändigini görkezýär. 20 sagatdan soň gurçukda birnäçe ullakan wakuol tapyldy. Bu gözegçilikler, C. eleganda metuozyň ilkinji hasabatyny görkezýär.
5 ýodoindol bilen bejerilen gurçuklarda wakuollaryň jemlenmegi we ýarylmagy hem ýüze çykypdyr (5-nji surat), gurçuklaryň egilmegi we wakuole daşky gurşawa çykmagy şaýatlyk edýär. Wakuolyň bozulmagy ýumurtga gabygynyň membranasynda-da ýüze çykdy, adatça ýumurtga çykanda L2 tarapyndan saklanýar (Goşmaça surat S2). Bu gözegçilikler, wakuol emele gelmek we supurasiýa prosesinde suwuklygyň toplanmagyny we osmoregulýator näsazlygyny, şeýle hem tersine öýjük şikesini (RCI) goldaýar (5-nji surat).
Gözegçilik edilýän wakuol emele gelmeginde ýodyň roluny çaklap, natriý ýodynyň (NaI) we kaliý ýodynyň (KI) nematid işjeňligini derňedik. Şeýle-de bolsa, konsentrasiýalarda (0,1, 0,5 ýa-da 1 mM), nematodyň ýaşamagyna ýa-da wakuol emele gelmegine täsir etmedi (goşmaça surat S5), 1 mM KI birneme nematisid täsirine eýe. Beýleki tarapdan, 5-ýodoindol ýaly 7-ýodindol (1 ýa-da 2 mM) köp wakuollary we gurluş deformasiýalaryny döretdi (S6 goşmaça surat). Iki ýodindol, sosna nematodlarynda meňzeş fenotip häsiýetleri görkezdi, NaI we KI bolsa ýok. Gyzykly tarapy, indol synag edilen konsentrasiýalarda B. ksilofilde wakuol emele gelmegine itergi bermedi (maglumatlar görkezilmeýär). Şeýlelik bilen, netijeler indil-ýod toplumynyň B. ksilofiliň wakuizasiýa we metabolizmi üçin jogapkärdigini tassyklady.
Nematisid işjeňligi üçin synag edilen indollaryň arasynda iň ýokary süýşmek görkezijisi -5.89 kkal / mol, ondan soň 7-ýodoindol (-4.48 kkal / mol), 4-ftorindol (-4.33) we indol (-4.03) bar (6-njy surat). 5-ýodoindolyň leýkine 218 bilen güýçli oňurgaly wodorod baglanyşygy, onuň baglanyşygyny durnuklaşdyrýar, beýleki ähli indol emele gelenler gapdal zynjyrly wodorod baglanyşyklary arkaly 260 serine baglanýar. Beýleki modellenen ýodindollaryň arasynda 2-ýodoindolyň esasy bahasy -5.248 kkal / mol, bu leýkine 218 bilen esasy wodorod baglanyşygy sebäpli ýüze çykýar. Beýleki belli baglanyşyklara 3-ýodoindol (-4.3 kkal / mol), 4-ýodoindol (-4.0 kkal / mol) we 6-florindol (6-florindol) goşulýar. Galogenleşdirilen indollaryň we indollaryň köpüsi, 5-ýodoindoldan we 2-ýodindoldan başga, 260 serin bilen baglanyşyk emele getirýär. 218-nji leýukin bilen wodorod baglanyşygynyň, ivermektin (goşmaça surat. S7) gözegçilik edişi ýaly, 5-ýodoindol we 2-ýodly berkitmäni tassyklaýar. Leucine 218 arkaly GluCL reseptory (6-njy surat we goşmaça surat S8). Bu baglanyşygyň, GluCL toplumynyň açyk gözenek gurluşyny saklamak üçin zerurdygyny we GluCL reseptorynyň, 5-ýodindolyň, 2-ýodindolyň, awermektiniň we iwermektiniň işjeň ýerine berk ýapyşmak bilen ion kanalynyň açyk saklanmagyny we suwuklygyň kabul edilmegine ýol açmagyny teklip edýäris.
GluCL-e indol we galogen indoluň molekulýar dokalmagy. (A) indol, (B) 4-ftorindol, (C) 7-ýodoindol we (D) 5-ýodindol baglary GluCL-iň işjeň ýerine baglaýjy ugurlary. Belok lenta bilen, oňurgaly wodorod baglanyşyklary sary punktir çyzyklar hökmünde görkezilýär. (A ′), (B ′), (C ′) we (D ′) degişli baglaryň daş-töweregindäki aminokislotanyň galyndylary bilen täsirini görkezýär, gapdal zynjyrly wodorod baglanyşyklary bolsa gülgüne nokatlar bilen görkezilýär.
5-ýodindolyň kelem we turp tohumlarynyň gögermegine zäherli täsirini bahalandyrmak üçin synaglar geçirildi. 5-ýodoindol (0.05 ýa-da 0,1 mM) ýa-da awermektin (10 μg / mL) başlangyç gögermegine we ösümlikleriň döremegine az täsir edipdir (7-nji surat). Mundan başga-da, bejerilmedik gözegçilikleriň gögeriş derejesi bilen 5-ýodoindol ýa-da awermektin bilen bejerilen tohumlaryň arasynda düýpli tapawut tapylmady. Düwürtigiň uzalmagyna we emele gelen gapdal kökleriň sanyna ujypsyzdy, 5 ýodoindolyň 1 mM (işjeň konsentrasiýasynyň 10 essesi) gapdal kökleriň ösüşini birneme gijikdirdi. Bu netijeler, 5-ýodoindolyň ösümlik öýjüklerine zäherli däldigini we öwrenilen konsentrasiýalarda ösümlikleriň ösüş proseslerine päsgel bermeýändigini görkezýär.
5-ýodindolyň tohumyň gögermegine täsiri. B. oleracea we R. raphanistrum tohumlarynyň Muraşige we Skoog agar gurşawynda avermektin ýa-da 5-ýodindol bilen gögermegi, gögermegi we gögermegi. Ösümlik 22 ° C-de 3 gün inkubasiýa edilenden soň hasaba alyndy.
Bu gözleg, nematodyň indoles tarapyndan öldürilmegi bilen baglanyşykly birnäçe hadysany habar berýär. Möhümi, bu sosna iňňelerinde ýodoindolyň metilizasiýany öňe sürýän ilkinji hasabatydyr (ýuwaş-ýuwaşdan ullakan vakuollara birleşip, membrananyň ýarylmagyna we ölümine sebäp bolýan ownuk wakuollaryň toplanmagy netijesinde dörän proses), ýodoindol täjirçilik nematisid awermektinine meňzeş möhüm nematisid häsiýetlerini görkezýär.
Olesetginjekleriň ozal prokaryotlarda we eukariotlarda biofilmiň saklanmagy / emele gelmegi, bakteriýalaryň diri galmagy we patogenligi ýaly birnäçe signal funksiýalaryny ýerine ýetirýändigi habar berildi19,32,33,34. Recentlyakynda, galogen indollaryň, indol alkaloidleriň we ýarym sintetiki indol önümleriniň bolup biläýjek bejeriş täsiri giň gözleg gyzyklanmalaryny döretdi 35,36,37. Mysal üçin, halogenleşdirilen indollaryň dowamly Escherichia coli we Staphylococcus aureus öýjüklerini öldürýändigi görkezildi37. Mundan başga-da, galogen indollaryň beýleki görnüşlere, görnüşlere we patyşalyklara garşy täsirini öwrenmek ylmy gyzyklanma döredýär we bu gözleg bu maksada ýetmek üçin ädimdir.
Bu ýerde, tersine öýjükleriň şikeslenmegine (RCI) we metilizasiýa (4C we 5-nji suratlar) esasynda C. eleganda 5-ýodoindol bilen örtülen ölüm mehanizmini teklip edýäris. Düwürtik we wakuolýar degenerasiýa ýaly ýiti üýtgeşmeler, sitoplazmada äpet vakuollar hökmünde ýüze çykýan RCI we metilizasiýanyň görkezijisidir. RCI, ATP önümçiligini azaltmak, ATPase nasosynyň näsazlygy ýa-da öýjük membranalarynyň bozulmagy we Na +, Ca2 + we suwuň çalt akmagyna sebäp bolmak bilen energiýa önümçiligine päsgel berýär50,51,52. Intrasitoplazmatiki vakuollar sitoplazmada Ca2 + we suwuň akmagy sebäpli suwuklygyň ýygnanmagy netijesinde haýwan öýjüklerinde ýüze çykýar53. Gyzykly tarapy, zyýan wagtlaýyn bolsa we öýjükler belli bir wagtlap ATP öndürip başlasa, öýjüklere zeper ýetirmegiň bu mehanizmi tersine bolup biler, ýöne zyýan dowam etse ýa-da erbetleşse, öýjükler ölýär.54 Gözegçiliklerimiz, 5-ýodoindol bilen bejerilen nematodlaryň stres ýagdaýlaryna sezewar bolandan soň adaty biosintezi dikeldip bilmeýändigini görkezýär.
B. ksilofilde 5-ýodoindol bilen ýüze çykarylan metilasiýa fenotipi, ýodyň bolmagy we molekulýar paýlanyşy sebäpli bolup biler, sebäbi 7-ýodoindol B. ksilofiline 5-ýodindoldan has az täsir ediji täsir edipdir (1-nji tablisa we S6 goşmaça surat). Bu netijeler Malta we başgalaryň gözlegleri bilen bölekleýin gabat gelýär. (2014), piridil azotyň indolda para-dan meta-pozisiýasyna terjime edilmegi, U251 öýjüklerinde wakuolizasiýany, ösüşiň päsgelçiligini we sitotoksikligi ýatyrdy, bu molekulanyň belokdaky belli bir işjeň ýer bilen özara täsiriniň möhümdigini görkezýär27,44,45. Bu işde syn edilen indol ýa-da galogen indollar bilen GluCL reseptorlarynyň arasyndaky täsirler hem bu düşünjäni goldaýar, sebäbi 5- we 2-ýodindol barlanylýan beýleki indollara garanyňda GluCL reseptorlary bilen has berk baglanyşýar (6-njy surat we S8 goşmaça surat). Indoluň ikinji ýa-da bäşinji ornundaky ýod, GluCL reseptorynyň oňurgaly wodorod baglanyşyklary arkaly 218 leýkine baglanjakdygy anyklandy, beýleki galogen indollar we indol 260 serin bilen gowşak zynjyrly wodorod baglanyşyklaryny emele getirýär (6-njy surat). Şonuň üçin galogeniň lokalizasiýasy wakuolýar degenerasiýanyň induksiýasynda möhüm rol oýnaýar diýip çaklaýarys, 5-ýodoindolyň berk baglanyşygy ion kanalyny açyk saklaýar we şeýlelik bilen suwuklygyň çalt akmagyna we wakuoluň ýarylmagyna ýol açýar. Şeýle-de bolsa, 5-ýodindolyň jikme-jik hereket mehanizmi kesgitlenmeli.
5-ýodoindoly amaly ulanmazdan ozal, onuň ösümliklere zäherleýji täsirini seljermeli. Tohum gögeriş synaglarymyz, 5-ýodoindolyň tohumyň gögermegine ýa-da öwrenilen konsentrasiýalarda soňraky ösüş proseslerine ýaramaz täsiriniň ýokdugyny görkezdi (7-nji surat). Şeýlelik bilen, bu gözleg sosna nematodlarynyň sosna agaçlaryna zyýanlylygyny gözegçilikde saklamak üçin ekologiki gurşawda 5-ýodindolyň ulanylmagy üçin esas döredýär.
Öňki hasabatlar, indol esasly bejerginiň antibiotik garşylygy we rak keseliniň ýokarlanmagy meselesini çözmek üçin potensial çemeleşmäni görkezýändigini görkezdi. Mundan başga-da, indollarda antibakterial, antikanser, antioksidant, çişmä garşy, antidiabetik, wirusa garşy, antiproliferatiw we inçekesele garşy çäreler bar we neşe serişdeleriniň ösmegi üçin geljegi uly esas bolup biler56,57. Bu gözleg, ýodyň antiparazit we anthelmintiki serişde hökmünde ulanylmagyny ilkinji gezek teklip edýär.
Awermektin üç on ýyl mundan ozal tapyldy we 2015-nji ýylda Nobel baýragyna mynasyp boldy, anthemintik hökmünde ulanylmagy henizem işjeň dowam edýär. Şeýle-de bolsa, nematodlarda we mör-möjek mör-möjeklerinde avermektinlere garşy çalt ösmegi sebäpli, sosna agaçlarynda PWN ýokaşmagyna gözegçilik etmek üçin alternatiw, arzan we ekologiýa taýdan arassa strategiýa zerur. Bu gözleg, 5-ýodoindolyň sosna nematodlaryny öldürýän mehanizmini we 5-ýodoindolyň ösümlik öýjüklerine az zäherliliginiň bardygyny habar berýär, bu bolsa geljekde täjirçilik taýdan ulanylmagy üçin gowy mümkinçilikleri açýar.
Synaglaryň hemmesi Koreýanyň Gyeongsan, ungungnam uniwersitetiniň etika komiteti tarapyndan tassyklandy we usullar ungungnam uniwersitetiniň etika komitetiniň görkezmelerine laýyklykda geçirildi.
Bellenen proseduralary ulanyp, ýumurtga inkubasiýa synaglary geçirildi43. Düwürtik derejesini (HR) bahalandyrmak üçin 1 günlük ulularyň nematodlary (takmynan 100 aýal we 100 erkek) kömelek saklaýan Petri tagamlaryna geçirildi we 24 sagadyň dowamynda ösmegine rugsat berildi. Soňra ýumurtga izolirlenip, steril distillendirilen suwda asma hökmünde 5-ýodindol (0,05 mM we 0,1 mM) ýa-da awermektin (10 μg / ml) bilen bejerildi. Bu süspansiýalar (500 μl; takmynan 100 ýumurtga) 24 guýy dokuma medeniýet plastinkasynyň guýularyna geçirildi we 22 ° C inkubasiýa edildi. L2 sanlar 24 sagat inkubasiýa edilenden soň edildi, ýöne inçe platina sim bilen gyjyndyrylanda öýjükler gymyldamasa ölü hasaplandy. Bu synag iki basgançakda geçirildi, hersi alty gezek gaýtalandy. Synaglaryň ikisi hem birleşdirildi we hödürlendi. HR göterimi aşakdaky ýaly hasaplanýar:
Uly ölüme ozal işlenip düzülen amallar ulanylyp baha berildi. Nematod ýumurtgalary ýygnaldy we düwünçekler L2 basgançak liçinkalaryny emele getirmek üçin steril distillendirilen suwda ýumurtga bilen sinhronlaşdyryldy. Sinhronlaşdyrylan liçinkalar (takmynan 500 nematod) 5 ýodoindol (0,05 mM we 0,1 mM) ýa-da awermektin (10 μg / ml) bilen bejerildi we B. cinerea Petri plitalarynda ösdürilip ýetişdirildi. 22 ° C-den 48 sagat inkubasiýa edilenden soň, nematodlar steril distillendirilen suwda ýygnalyp, L2, L3 we L4 tapgyrlarynyň bardygyny barladylar. L3 we L4 tapgyrlarynyň bolmagy liçinkalaryň üýtgemegini görkezýär, L2 tapgyrynyň bolmagy bolsa hiç hili üýtgemäni görkezmeýär. Suratlar iRiS ™ sanly öýjük şekillendiriş ulgamy arkaly alyndy. Bu synag iki basgançakda geçirildi, hersi alty gezek gaýtalandy. Synaglaryň ikisi hem birleşdirildi we hödürlendi.
5-ýodoindolyň we awermektiniň tohumlara zäherliligi Muraşige we Skoog agar plitalarynda gögerijilik synaglary arkaly bahalandyryldy.62 B. oleracea we R. raphanistrum tohumlary ilkinji gezek steril distillendirilen suwa batyryldy, 1 ml 100% etanol bilen sterilizasiýa edildi, 1 ml 50% täjirçilik akartma (3% natriý gipoh) bilen sterilizasiýa edildi. Soňra sterilizasiýa edilen tohumlar 0,86 g / l (0,2X) Muraşige we Skoog orta we 0,7% bakteriologiki agar 5-ýodindol ýa-da avermektin bilen ösýän agar plitalaryna basyldy. Soňra tabaklar 22 ° C-de inkubasiýa edildi we 3 gün inkubasiýa edilenden soň suratlar alyndy. Bu synag iki basgançakda geçirildi, olaryň hersinde alty gezek gaýtalandy.
Iş wagty: Fewral-26-2025