Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Ulanylýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS goldawy çäklidir.Iň oňat netijeler üçin brauzeriňiziň has täze wersiýasyny ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil ýa-da JavaScript görkezmeýäris.
Tebigy önümleriň tapylmagy we peýdaly ulanylmagy adam durmuşyny gowulaşdyryp biler.Ösümlikleriň ösmegini saklaýan himiki maddalar haşal otlara gözegçilik etmek üçin gerbisidler hökmünde giňden ulanylýar.Dürli gerbisidleri ulanmagyň zerurlygy sebäpli täze hereket mehanizmleri bilen birleşmeleri kesgitlemeli.Bu gözlegde, Streptomyces werraensis MK493-CF1-den N -alkoxypyrrole birleşmesini, coumamonamide tapdyk we doly sintez prosesini döretdik.Biologiki işjeňlik gözlegleriniň netijesinde urs-monoam turşusynyň urs-monoamidiň sintetiki aralygydygyny we potensialynyň bardygyny anykladyk.ösümlikleriň ösüş inhibitory.Mundan başga-da, HeLa öýjükleriniň ösmegine ýaramaz täsir etmezden ýokary gerbisid işjeňligi bolan urbeniloksi emele getiriji (UDA) ýaly dürli urbenon turşulyk önümlerini döretdik.Şeýle hem, urmoton kislotasynyň emele gelişleriniň ösümlik mikrotubularyny bozýandygyny gördük;Mundan başga-da, KAND aktin filamentlerine täsir edýär we öýjükleriň ölmegine sebäp bolýar;Bu köptaraply täsirler belli mikrotubula inhibitorlaryndan tapawutlanýar we täze gerbisidleriň ösmeginde möhüm artykmaçlygy görkezýän urson kislotasy üçin täze hereket mehanizmini teklip edýär.
Peýdaly tebigy önümleriň tapylmagy we amaly taýdan ulanylmagy adam durmuşynyň hilini ýokarlandyrmagyň serişdesidir.Mikroorganizmler, ösümlikler we mör-möjekler tarapyndan öndürilýän ikinji derejeli metabolitler lukmançylykda we oba hojalygynda uly ösüşlere sebäp boldy.Köp antibiotikler we leýkoz garşy dermanlar tebigy önümlerden öndürildi.Mundan başga-da, dürli görnüşlerpestisidler, fungisidler we gerbisidler oba hojalygynda ulanmak üçin bu tebigy önümlerden alynýar.Hususan-da, haşal otlara garşy gerbisidler häzirki zaman oba hojalygynda ekin hasylyny ýokarlandyrmak üçin möhüm gural bolup, dürli görnüşli birleşmeler eýýäm söwda taýdan ulanylýar.Fotosintez, aminokislotanyň alyş-çalşy, öýjük diwary sintezi, mitozyň kadalaşdyrylmagy, fitohormon duýduryşy ýa-da belok sintezi ýaly ösümliklerdäki birnäçe öýjükli amallar gerbisidleriň adaty nyşany hasaplanýar.Mikrotubula funksiýasyny saklaýan birleşmeler, mitotik kadalaşdyryşa täsir edip ösümlikleriň ösmegine täsir edýän gerbisidleriň umumy synpy2.
Mikrotubulalar sitoskeletiň düzüm bölegi bolup, eukariotik öýjüklerinde giňden saklanýar.Tubulin heterodimeri, silindr gurluşyny emele getirýän çyzykly mikrotubula protofilamentlerini emele getirýän α-tubulinden we β-tubulinden durýar.Mikrotubulalar öýjük öýjükleriniň görnüşini, öýjükleriň bölünişini we öýjükli transporty kesgitlemek ýaly ösümlik öýjüklerinde birnäçe rol oýnaýar.Ösümlik öýjüklerinde interfaza plazma membranasynyň aşagyndaky mikrotubulalar bar we kortikal mikrotubulalar diýilýän zat, sellýuloza sintaz toplumlaryny kadalaşdyrmak arkaly sellýuloza mikrofibrilleriniň guralyşyna gözegçilik eder öýdülýär4,5.Kök ujunyň çalt uzalýan zonasynda bar bolan kök epidermal öýjükleriniň kortikal mikrotubulary gyrada ýerleşýär we sellýuloza mikrofiberleri bu mikrotubulalary yzarlaýarlar we öýjükleriň giňeliş ugruny çäklendirýärler, şeýlelik bilen anizotrop öýjükleriň uzalmagyna kömek edýärler.Şonuň üçin mikrotubula funksiýasy ösümlik morfologiýasy bilen ýakyndan baglanyşyklydyr.Tubulini kodlaýan genlerdäki aminokislotanyň ornuny tutmagy, kortikal mikrotubula massiwleriniň çişmegine we Arabidopsis 6,7-de çep ýa-da sag tarapyň ösmegine sebäp bolýar.Şonuň ýaly-da, mikrotubula dinamikasyny kadalaşdyrýan mikrotubula bagly beloklardaky mutasiýa, köküň ýoýulmagyna sebäp bolup biler8,9,10,11,12,13.Mundan başga-da, pretilahlor diýlip hem bilinýän disopiramid ýaly mikrotubulalary bozýan gerbisidler bilen bejermek, çep tarapdaky obli köküň ösmegine sebäp bolýar14.Bu maglumatlar, mikrotubula funksiýasyny takyk düzgünleşdirmegiň ösümlikleriň ösüş ugruny kesgitlemek üçin möhümdigini görkezýär.
Dürli mikrotubula inhibitorlary tapyldy we bu dermanlar öýjük-skelet barlaglaryna, oba hojalygyna we lukmançylyga möhüm goşant goşdy2.Hususan-da, oryzalin, dinitroanilin birleşmeleri, disopiramid, benzamid bilen baglanyşykly birleşmeler we olaryň analoglary mikrotubulalaryň işini saklap biler we şeýlelik bilen ösümlikleriň ösmegini bökdäp biler.Şonuň üçin gerbisidler hökmünde giňden ulanylýar.Şeýle-de bolsa, mikrotubulalar ösümlik we haýwan öýjükleriniň möhüm düzüm bölegi bolany üçin, mikrotubula inhibitorlarynyň köpüsi öýjükleriň ikisine-de sitotoksikdir.Şonuň üçin gerbisidler hökmünde ykrar edilendigine garamazdan, amaly maksatlar üçin çäkli mukdarda antimikrotubula serişdeleri ulanylýar.
Streptomiýes, aerob, gram-pozitiw, filamentli bakteriýalary öz içine alýan we ikinji derejeli metabolitleri öndürmek ukyby bilen giňden tanalýan Streptomyces maşgalasynyň bir görnüşidir.Şonuň üçin täze biologiki taýdan işjeň tebigy önümleriň iň möhüm çeşmelerinden biri hasaplanýar.Häzirki gözlegde, Streptomyces werraensis MK493-CF1 we S. werraensis ISP 5486-dan izolirlenen coumamonamide atly täze birleşmäni tapdyk, spektral derňewi we doly spektral derňewi ulanyp, kumamonamidiň gurluşy häsiýetlendirildi we özboluşly N-alkoksipirrol skeleti kesgitlenildi.sintezi.Ursmonoamidiň we olardan emele gelen sintetiki aralyk bolan Ursmon kislotasy, meşhur Arabidopsis taliana ösümliginiň ösmegine we gögermegine päsgel berýän tapyldy.Gurluş-işjeňlik gatnaşyklaryny öwrenmekde, urson kislotasyna (KAND) noniloksi emele getiriji diýlip atlandyrylýan urson kislotasyna üýtgedilen C9 birleşmesiniň ösmegine we gögermegine päsgelçilik täsirini ep-esli ýokarlandyrýandygyny gördük.Ablyeri gelende aýtsak, täze açylan ösümlikleriň ösmeginiň inhibitory temmäki we bagyr ösümligine hem täsir etdi we bakteriýalara ýa-da HeLa öýjüklerine sitotoksiki däldi.Mundan başga-da, käbir urmoton kislotasy emele gelenler kök fenotipini ýoýup, bu emele gelenleriň mikrotubulalara göni ýa-da gytaklaýyn täsir edýändigini aňladýar.Bu pikire laýyk gelýän immunohistohimiki ýa-da floresan beloklar bilen bellik edilen mikrotubulalara gözegçiliklerimiz, KAND bejergisiniň mikrotubulary depolimerleşdirýändigini görkezýär.Mundan başga-da, kumamoton kislotasynyň emele gelenleri bilen bejermek aktin mikrofilamentlerini bozdy.Şeýlelik bilen, özboluşly hereket mehanizmi sitoskeletiň ýok edilmegini öz içine alýan täze ösümlik ösüş inhibitoryny tapdyk.
MK493-CF1 ştammy Tokionyň Şinagawa-ku topragyndan izolirlendi.MK493-CF1 ştammy gowy şahaly stromal miseliumy emele getirdi.16S ribosomal RNK geniniň (1422 bp) bölekleýin yzygiderliligi kesgitlenildi.Bu ştamm S. werraensise gaty meňzeýär (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: adaty ştamm, 99,93%).Bu netijä esaslanyp, bu ştammyň S. werraensis görnüşi bilen ýakyndan baglanyşyklydygy kesgitlenildi.Şonuň üçin wagtlaýynça bu ştammy S. werraensis MK493-CF1 diýip atlandyrdyk.S. werraensis ISP 5486T hem şol bir bioaktiw birleşmeleri öndürýär.Bu mikroorganizmden tebigy önümleri almak barada irki gözlegler az bolansoň, has himiki gözlegler geçirildi.S. werraensis MK493-CF1 arpa gurşawynda 14 günüň dowamynda 30 ° C derejesinde gaty fermentasiýa arkaly ösdürilip ýetişdirilenden soň, serişde 50% EtOH bilen çykaryldy.59,5 mg çig ekstrakt almak üçin 60 ml nusga guradyldy.Çig ekstrakt, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, coumamonamid, 36.0 mg) bermek üçin HPLC tersine faza sezewar edildi.Jemi 1 mukdary çig ekstraktyň takmynan 60% -ini düzýär.Şonuň üçin kumamotoamid 1-iň aýratynlyklaryny jikme-jik öwrenmegi makul bildik.
Coumamonamide 1 ak amorf tozy we ýokary çözgütli köpçülik spektrometri (HRESIMS) C6H8N2O2 tassyklaýar (1-nji surat).Bu birleşmäniň C2 bilen çalşylan pirol bölegi δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4,8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR spektrinde: 4,5 Hz) bilen häsiýetlendirilýär. , H-5) we δH 6.78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) we 13C NMR spektri dört sp2 uglerod atomynyň bardygyny görkezýär.C2 ýagdaýynda amid toparynyň bolmagy, HMBC korrelýasiýasy bilen C-3 protondan amid karbonil uglerodyna δC 161.1 derejesinde baha berildi.Mundan başga-da, 1 H we 13 C NMR iň ýokary derejesi δH 4.10 (3H, S) we δC 68.3 molekulada N-metoksi toparlarynyň bardygyny görkezýär.Metoksi toparynyň dogry ýagdaýy entek güýçlendirilen tapawut spektroskopiýasy we ýadro abatlaýyş gysgaltmasy (NOEDF) ýaly spektroskopiki derňewi ulanyp kesgitlenmedik hem bolsa, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid ilkinji dalaşgär birleşmesi boldy.
1-iň dogry gurluşyny kesgitlemek üçin jemi sintez edildi (2a surat).Söwda taýdan elýeterli 2-aminopiridin 2-ni m-CPBA bilen bejermek, mukdar taýdan hasyl almakda degişli N-oksid 3-e sebäp boldy.2-aminazidasiýadan soň, Abramowiç tarapyndan beýan edilen siklokondensasiýa reaksiýasy, gramda islenýän 1-gidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 almak üçin 90 ° C derejesinde benzolda geçirildi.Tizlik 60% (iki basgançak).15,16.4-den metilizasiýa we gidroliz 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksil turşusyny (“kumoton turşusy” diýilýär, 6) oňat hasyl berdi (70%, iki ädim).Ahyrynda, suwly ammiak ulanyp, kislota hlorid aralyk 6 arkaly amidasiýa Kumamoto amidini 98% hasyl berdi.Sintezlenen 1-iň ähli spektral maglumatlary izolirlenen 1-e meňzeýärdi, şonuň üçin 1-iň gurluşy kesgitlenildi;
Urbenamidiň we urben kislotasynyň biologiki işjeňliginiň umumy sintezi we derňewi.(a) Kumamoto amidiň jemi sintezi.(b) Sevenedi günlük ýabany görnüşli Arabidopsis Columbia (Col) nahallary görkezilen konsentrasiýalarda kumamonamid 6 ýa-da coumamonamid 1 bolan Muraşige we Skoog (MS) tabaklarynda ösdürilip ýetişdirildi.Tereziniň çyzgysy = 1 sm.
Ilki bilen, urbenamidiň we onuň araçylarynyň biologiki işjeňligini ösümlikleriň ösüşini modulirlemek ukybyna baha berdik.MS agar orta we medeniýetli Arabidopsis taliana nahallaryna dürli konsentrasiýa ursmonamid 1 ýa-da ursmon kislotasy 6 goşduk.Bu gözlegler, 6-dan ýokary konsentrasiýalaryň (500 μM) kök ösmegini saklaýandygyny görkezdi (2-nji surat).Ondan soň, N1 pozisiýasyny 6-nyň ornuny tutup, dürli emele gelenler döretdik we olaryň üstünde gurluş-işjeňlik gatnaşyklaryny geçirdik (analog sintez prosesi Goldaw maglumatlarynda (SI) beýan edilýär).Arabidopsis nahallary 50 μM urson kislotasyny emele getirýän gurşawda ösdürilip ýetişdirildi we kök uzynlygy ölçenildi.suratda görkezilişi ýaly.3a, b we S1 suratlarda görkezilişi ýaly, kumamo kislotalary dürli uzynlykdaky çyzykly alkoksi zynjyrlara (9, 10, 11, 12 we 13) ýa-da N1 ýagdaýynda uly alkoksi zynjyrlaryna eýe (15, 16 we 17).Gurallar köküň ösmeginiň ep-esli päsgelçiligini görkezdi.Mundan başga-da, 200 μM 10, 11 ýa-da 17 ulanylmagynyň gögerijiliginiň saklanandygyny gördük (3c we S2 suratlar).
Kumamoto amidiň we oňa bagly birleşmeleriň gurluş-işjeňlik gatnaşyklaryny öwrenmek.(a) Analoglaryň gurluşy we sintezi shemasy.(b) MS ortaça 50 μM kumamonamid emele gelen ýa-da bolmazdan ösdürilip ýetişdirilen 7 günlük nahallaryň kök uzynlygynyň mukdary.Asterisks ýasama bejergisi bilen düýpli tapawutlary görkezýär (t test, s<0.05).n>18. Maglumatlar ortaça ± SD görnüşinde görkezilýär.nt "synagdan geçirilmeýär" diýmekdir, sebäbi tohumlaryň 50% -den gowragy gögermedi.(c) 200 μM coumamonamid we şuňa meňzeş birleşmeler bilen MS gurşawynda 7 günüň dowamynda inkubasiýa edilen bejerilen tohumlaryň gögeriş derejesiniň mukdary.Asteriskler ýasama bejerginiň (ç-kwadrat synagy) düýpli tapawutlaryny görkezýär.n = 96.
Gyzykly tarapy, alkil gapdal zynjyrlarynyň C9-dan has uzyn bolmagy, inhibitasiýa işjeňligini peseldip, kumamotoik kislota bilen baglanyşykly birleşmeleriň biologiki işjeňligini görkezmek üçin belli bir ululykdaky zynjyrlary talap edýändigini görkezýär.
Gurluş-işjeňlik gatnaşyklarynyň derňewi, C9-nyň urson kislotasyna üýtgedilendigini we urson kislotasynyň noniloksi emele gelşiniň (mundan beýläk KAND 11 diýlip atlandyrylýar) ösümligiň ösüşiniň iň täsirli inhibitorydygy sebäpli, KAND 11. has jikme-jik häsiýetnama geçirdik. Arabidopsisiň bejergisi 50 μM KAND 11 bilen gögermegiň düýbünden öňüni aldy, KAND 11-iň pes konsentrasiýalary (40, 30, 20 ýa-da 10 μM) dozalara baglylykda kök ösmegini bökdedi (4a surat, b).KAND 11-iň kök meristemiň ýaşaýyş ukybyna täsir edýändigini ýa-da ýokdugyny barlamak üçin, propidium ýod (PI) bilen boýalan kök meristemleri gözden geçirdik we meristem meýdanynyň ululygyny ölçedik.25 μM KAND-11 saklaýan gurşawda ösdürilip ýetişdirilen nahallaryň meristeminiň ululygy 151,1 ± 32.5 mk, DMSO saklaýan gözegçilik gurşawynda ösdürilip ýetişdirilen nahallaryň meristeminiň ululygy 264,7 ± 30,8 μm (4c-nji surat, d) , KAND-11 öýjükli işjeňligi dikeldýändigini görkezýär.ýaýramagy.Kök meristem.Şoňa laýyklykda KAND 11 bejergisi CDKB2 öýjük bölüniş markeriniň mukdaryny azaltdy; 1p :: CDKB2; kök meristeminde 1-GUS signaly (4e surat) 17.Bu netijeler, KAND 11-iň öýjükleriň köpelmegini azaltmak bilen köküň ösmegini bökdeýändigini görkezýär.
Urbenon kislotasynyň emele gelenleriniň (urbeniloksi emele gelenleriň) ösüşine päsgel berýän täsiriniň derňewi.(a) KAND 11 görkezilen konsentrasiýalary bilen MS plitalarynda ösdürilip ýetişdirilen 7 günlük ýabany görnüşli Col nahallary. Tereziniň ölçegi = 1 sm.(b) Kök uzynlygynyň mukdary.Hatlar möhüm tapawutlary görkezýär (Tukey HSD synagy, s<0.05).n>16. Maglumatlar ortaça ± SD görnüşinde görkezilýär.(c) 25 μM KAND bilen ýa-da bolmazdan MS plitalarynda ösdürilip ýetişdirilýän propidium ýod reňkli ýabany görnüşli Col kökleriniň konfokal mikroskopiýasy. Ak ýaýlar kök meristemini görkezýär.Tereziniň çyzgysy = 100 µm.(d) Kök meristeminiň mukdary (n = 10-dan 11-e çenli).Statistik tapawutlar t-test (sah<0.05).Barlar ortaça meristem ululygyny görkezýär.(e) CDKB2 konstruksiýasyny öz içine alýan kök meristemiň diferensial päsgelçilik kontrasty (DIC) mikroskopiýasy;1pro: CDKB2;1-GUS, 25 µM KAND analizi bilen ýa-da bolmazdan, MS plitalarynda ösdürilip ýetişdirilen 5 günlük nahallara boýaldy we reňklendi.
KAND 11-iň fitotoksikligi başga bir dikotiledonly ösümlik, temmäki (Nikotiana tabacum) we esasy ösümlik ösümlik modeli organizm, bagyr (Marchantia polymorpha) ulanylyp synagdan geçirildi.Arabidopsisde bolşy ýaly, 25 μM KAND 11 bolan ortaça ösdürilip ýetişdirilen temmäki SR-1 nahallary has gysga kök öndürdi (5a surat).Mundan başga-da, 48 tohumdan 40-sy 200 μM KAND 11 bolan tabaklarda gögerdi, 48 tohumyň hemmesi masgaralanan mediýada gögerdi, bu bolsa KAND-yň ýokary konsentrasiýasynyň möhümdigini görkezýär (p<0.05;chi test -square) temmäkiniň gögermegini saklady.(5b-nji surat).Mundan başga-da, bagyr bagynda bakteriýalaryň ösmegini saklaýan KAND 11 konsentrasiýasy Arabidopsisdäki täsirli konsentrasiýa meňzeýärdi (5-nji surat).Bu netijeler, KAND 11-iň dürli ösümlikleriň ösmegine päsgel berip biljekdigini görkezýär.Soňra beýleki organizmlerde aýy monoamid bilen baglanyşykly birleşmeleriň sitotoksikligini, has ýokary haýwan we bakteriýa öýjükleriniň wekili hökmünde adam HeLa öýjükleri we Escherichia coli ştammy DH5α derňedik.Öýjükleriň köpelmeginiň gözlegleriniň birnäçesinde coumamonamid 1, coumamonamid kislotasy 6 we KAND 11-iň 100 μM konsentrasiýalarynda HeLa ýa-da E. coli öýjükleriniň ösmegine täsir etmeýändigini gördük (5d surat, e).
Arabidopsis däl organizmlerde KAND 11-iň ösüşi.(a) Iki hepdelik ýabany görnüşli SR-1 temmäki nahallary dikligine ýerleşýän MS plitalarynda 25 μM KAND 11 ösdürilip ýetişdirildi (b) Iki hepdelik ýabany görnüşli SR-1 temmäki nahallary keseligine ýerleşdirildi. 200 μM KAND 11. öz içine alýan MS plitalary. döwür.d) HeLa öýjükleriniň öýjükleriň köpelmegi.Öýjük sanamak toplumy 8 (Dojindo) ulanyp, ýaşaýyş öýjükleriniň sany belli wagt aralygynda ölçenildi.Dolandyryş hökmünde HeLa öýjükleri RNK polimeraza transkripsiýasyny saklaýan we öýjükleriň ölmegine sebäp bolýan 5 μg / ml aktinomisin D (akt D) bilen bejerildi.Derňewler üç nusgada geçirildi.(e) E. coli öýjükleriniň köpelmegini öwrenmek.E. coli ösüşi OD600 ölçemek arkaly derňeldi.Gözegçilik hökmünde öýjükler bakteriýa öýjük diwarynyň sintezini saklaýan 50 μg / ml ampisillin (Amp) bilen bejerildi.Derňewler üç nusgada geçirildi.
Uramid bilen baglanyşykly birleşmeler sebäpli dörän sitotoksiklikiň hereket mehanizmini kesgitlemek üçin, ortaça inhibitor täsirleri bilen urben kislotasynyň emele gelenlerini gaýtadan analiz etdik.suratda görkezilişi ýaly.2b, 6a suratlarda görkezilişi ýaly, urmoton kislotasynyň ýokary konsentrasiýasy (200 μM) bolan agar tabaklarynda ösdürilip ýetişdirilen nahallar gysga we çep egrilen kökleri (θ = - 23,7 ± 6.1) öndürýär, gözegçilik gurşawynda ösdürilip ýetişdirilen nahallar bolsa, nahallar göni diýen ýaly kök öndürýärdi (θ = - 3,8 ± 7.1).Bu häsiýetli obli ösüş, kortikal mikrotubularyň işlemezligi netijesinde ýüze çykýar14,18.Bu tapyndy bilen yzygiderli mikrotubulary durnuksyzlaşdyrýan dermanlar disopiramid we oryzalin ösüş şertlerimizde şuňa meňzeş köküň egilmegine sebäp boldy (2b, 6a suratlar).Şol bir wagtyň özünde, urmoton kislotasynyň emele gelenlerini barladyk we belli bir konsentrasiýalarda obli köküň ösmegine sebäp bolan birnäçesini saýladyk.8, 9 we 15 birleşmeler kökleriň ösüş ugruny degişlilikde 75 μM, 50 μM we 40 μM üýtgetdi, bu birleşmeleriň mikrotubulary durnuksyzlaşdyryp biljekdigini görkezýär (2b, 6a surat).Şeýle hem, iň güýçli konsentrasiýada (15 µM) iň güýçli ursol turşusyny emele getirýän KAND 11-i synagdan geçirdik we KAND 11-iň ulanylmagynyň kök ösmeginiň öňüni alýandygyny we çepe eňňit edýändiklerine garamazdan kök ösmeginiň ugrunyň deň däldigini anykladyk ( Surat C3)..Mikrotubulary durnuksyzlaşdyrýan dermanlaryň has köp konsentrasiýasy köküň egilmegine sebäp bolman, kämahal ösümligiň ösmegine päsgel berýändigi sebäpli, KAND 11-iň kök epidermal öýjüklerindäki kortikal mikrotubulary synlamak arkaly mikrotubulalara täsir edip biljekdigine baha berdik.25 μM KAND 11 bilen bejerilen nahal kökleriniň epidermal öýjüklerinde anti-tubuline garşy antikorlary ulanmak bilen immunohistohimiýa, uzalma zonasyndaky epidermal öýjüklerdäki kortikal mikrotubularyň hemmesiniň diýen ýaly ýok bolandygyny görkezdi (6b surat).Bu netijeler kumamoton turşusynyň we olardan emele gelenleriň mikrotubulalary bozmak üçin göni ýa-da gytaklaýyn hereket edýändigini we bu birleşmeleriň täze mikrotubula ingibitorlarydygyny görkezýär.
Urson kislotasy we olardan emele gelenler Arabidopsis talianadaky kortikal mikrotubulary üýtgedýär.(a) Görkezilen konsentrasiýalarda dürli urmoton kislotasynyň emele gelenlerinde bar bolan kök ýapgyt burçy.Mikrotubulary saklaýan belli iki birleşmäniň täsiri: disopiramid we oryzalin.Goşundyda kök ösüş burçuny ölçemek üçin ulanylýan standart görkezilýär.Asterisks ýasama bejergisi bilen düýpli tapawutlary görkezýär (t test, s<0.05).n>19. Tereziniň çyzgysy = 1 sm.(b) Uzalma zonasyndaky epidermal öýjüklerdäki kortikal mikrotubulalar.25 μM KAND 11 bolan ýa-da bolmazdan MS plitalarynda ösdürilip ýetişdirilýän ýabany görnüşli Arabidopsis Col kökleri mikrotubulalar, tubohulin esasy antikorlary we Alexa Fluor-conjugated ikinji antikorlary ulanyp, immunohistohimiki boýag arkaly şekillendirildi.Tereziniň çyzgysy = 10 µm.c) kök meristemdäki mikrotubularyň mitotik gurluşy.Mikrotubulalar immunohistohimiki boýag arkaly şekillendirilipdir.Propaz zolaklary, şpilkalar we fragmoplastlar ýaly mitotik gurluşlar konokok şekillerden sanaldy.Oklar mitotik mikrotubula gurluşlaryny görkezýär.Asterisks ýasama bejergisi bilen düýpli tapawutlary görkezýär (t test, s<0.05).n>9. Tereziniň çyzgysy = 50 µm.
Ursa mikrotubulalaryň işini bozmak ukybyna eýe bolsa-da, hereket mehanizminiň adaty mikrotubula depolimerleýji serişdelerinden tapawutly bolmagyna garaşylýar.Mysal üçin, disopiramid we oryzalin ýaly mikrotubula depolimerleşdiriji serişdeleriň has köp konsentrasiýasy epidermal öýjükleriň anizotrop giňelmegine sebäp bolýar, KAND 11 bolsa ýok.Mundan başga-da, KAND 11 bilen disopiramidiň bilelikde ulanylmagy, disopiramid bilen örtülen köküň ösmegine täsir etdi we KAND 11-induksion ösüş inhibisiýasy hasaba alyndy (S4-nji surat).Şeýle hem, aşa duýgur disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantyň KAND 11-e bolan jogabyny analiz etdik.KAND 11-i öz içine alýan agar ösümliginde ösdürilip ýetişdirilen phs1-1 mutant nahallary, disopiramidada ösdürilip ýetişdirilenlere meňzeş gysga kökleri bardy (S5-nji surat).
Mundan başga-da, KAND 11 bilen bejerilen nahallaryň kök meristeminde propaz zonalary, pyçaklar we fragmoplastlar ýaly mitotik mikrotubula gurluşlaryny gördük, CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS, ep-esli azalma; mitotik mikrotubularyň sany hasaba alyndy (6-njy surat).
KAND 11-iň sitotoksikligini öýjükli rezolýusiýada häsiýetlendirmek üçin, temmäki BY-2 asma öýjüklerini KAND 11 bilen bejerdik we olaryň seslenmesine syn etdik.KAND 11-iň kortikal mikrotubulalara täsirini bahalandyrmak üçin ilki bilen mikrotubulary floresan bellik edýän TagRFP-TUA6 aňladýan BY-2 öýjüklerine KAND 11 goşduk.Kortikal mikrotubula dykyzlygy sitoplazmatiki pikselleriň arasynda sitoskelet pikseliniň göterimini kesgitleýän şekil derňewi arkaly baha berildi.Gözlegiň netijeleri, 50 μM ýa-da 100 μM KAND 11 bilen 1 sagadyň dowamynda bejergiden soň dykyzlygynyň ep-esli derejede 0,94 ± 0.74% ýa-da 0,23 ± 0,28% peselendigini, DMSO bilen bejerilen öýjükleriň dykyzlygynyň bolsa 1,61 ± 0.34 bolandygyny görkezdi. % (7a surat).Bu netijeler, Arabidopsisdäki KAND 11 bejergisiniň kortikal mikrotubulalaryň depolimerizasiýasyna sebäp bolýandygy baradaky syn bilen gabat gelýär (6b surat).Şeýle hem, KAND 11 konsentrasiýasy bilen bejergiden soň GFP-ABD belgili aktin filamentleri bilen BY-2 setirini gözden geçirdik we KAND 11 bejergisiniň aktin filamentlerini bozandygyny gördük.50 μM ýa-da 100 μM KAND 11 bilen bejermek, 1 sagadyň dowamynda aktin filamentiniň dykyzlygyny ep-esli derejede 1,20 ± 0.62% ýa-da 0,61 ± 0,26% çenli peseldi, DMSO bilen bejerilen öýjükleriň dykyzlygy bolsa 1,69 ± 0.51% boldy (2-nji surat).7b).Bu netijeler, aktin filamentlerine täsir etmeýän propyzamidiň we mikrotubulalara täsir etmeýän aktin depolimerizatorynyň latrunculin B-den tapawutlanýar (SI Surat S6).Mundan başga-da, kumamonamid 1, coumamonamid kislotasy 6 ýa-da KAND 11 bilen bejermek HeLa öýjüklerindäki mikrotubulalara täsir etmedi (SI Surat S7).Şeýlelik bilen, KAND 11-iň hereket mehanizmi belli sitoskelet bozujylaryndan tapawutly hasaplanýar.Mundan başga-da, KAND 11 bilen bejerilen BY-2 öýjüklerine mikroskopik gözegçilikimiz, KAND 11 bejergisinde öýjük ölüminiň başlanandygyny ýüze çykardy we KAND 11 bejergisinden 30 minut soň gök reňkli öli öýjükleriň paýynyň ep-esli ýokarlanmandygyny görkezdi. 50 μM ýa-da 100 μM KAND bilen 90 minutlyk bejergiden soň ölen öýjükleriň sany degişlilikde 43,7% ýa-da 80.1% -e çenli ýokarlandy (7-nji surat).Bu maglumatlar bilelikde alnanda, KAND 11 romandaky ursolik kislotadan emele gelen, ozal belli bolmadyk hereket mehanizmi bolan ösümliklere mahsus sitoskelet inhibitorydygyny görkezýär.
KAND kortikal mikrotubulara, aktin filamentlerine we temmäki BY-2 öýjükleriniň ýaşaýyş ukybyna täsir edýär.(a) TagRFP-TUA6-nyň gatnaşmagynda BY-2 öýjüklerinde kortikal mikrotubulary wizuallaşdyrmak.KAND 11 (50 μM ýa-da 100 μM) ýa-da DMSO bilen bejerilen BY-2 öýjükleri konokok mikroskopiýa bilen barlandy.Kortikal mikrotubula dykyzlygy 25 garaşsyz öýjügiň mikrograflaryndan hasaplandy.Hatlar möhüm tapawutlary görkezýär (Tukey HSD synagy, s<0.05).Tereziniň çyzgysy = 10 µm.(b) GFP-ABD2 barlygynda şekillendirilen BY-2 öýjüklerindäki kortikal aktin filamentleri.KAND 11 (50 μM ýa-da 100 μM) ýa-da DMSO bilen bejerilen BY-2 öýjükleri konokok mikroskopiýa bilen barlandy.Kortikal aktin filamentleriniň dykyzlygy 25 garaşsyz öýjügiň mikrograflaryndan hasaplandy.Hatlar möhüm tapawutlary görkezýär (Tukey HSD synagy, s<0.05).Tereziniň çyzgysy = 10 µm.(c) Ölüleriň BY-2 öýjüklerini Ewansyň gök reňk bilen synlamagy.KAND 11 (50 μM ýa-da 100 μM) ýa-da DMSO bilen bejerilen BY-2 öýjükleri açyk meýdan mikroskopiýasy bilen barlandy.n = 3.Tereziniň çyzgysy = 100 µm.
Täze tebigy önümleriň tapylmagy we ulanylmagy adam durmuşynyň dürli ugurlarynda, şol sanda lukmançylyk we oba hojalygynda möhüm ösüşlere sebäp boldy.Tebigy baýlyklardan peýdaly birleşmeler almak üçin taryhy gözlegler geçirildi.Hususan-da, aktinomisetler nematodlar üçin antiparazit antibiotikleri hökmünde peýdalydygy belli, avermektin, iwermektin we bleomisin gurşun birleşmesi we ondan emele gelenler ýaly dürli ikinji metabolitleri öndürmek ukyby sebäpli dermanlara garşy antikanser serişdesi hökmünde ulanylýar21,22.Edil şonuň ýaly-da, aktinomisetlerden dürli gerbisid birleşmeleri tapyldy, olaryň käbiri eýýäm täjirçilik taýdan ulanylýar1,23.Şonuň üçin tebigy önümleri islenýän biologiki işjeňlik bilen izolirlemek üçin aktinomiset metabolitleriniň derňewi täsirli strategiýa hasaplanýar.Bu gözlegde, S. werraensisden coumamonamid atly täze birleşmäni tapdyk we ony üstünlikli sintez etdik.Urson kislotasy urbenamidiň we olardan emele gelen sintetiki aralykdyr.Bu häsiýetli köküň gysylmagyna sebäp bolup biler, orta we güýçli gerbisid işjeňligini görkezip biler we ösümlik mikrotubulalaryna göni ýa-da gytaklaýyn zeper ýetirip biler.Şeýle-de bolsa, urmoton turşusynyň hereket mehanizmi bar bolan mikrotubula inhibitorlaryndan tapawutlanyp biler, sebäbi KAND 11 aktin filamentlerini hem bozýar we öýjükleriň ölümine sebäp bolýar, bu urmoton kislotasynyň we emele gelenleriň sitoskelet gurluşlarynyň giň toparyna täsir edýän kadalaşdyryjy mehanizmi teklip edýär..
Urbenon kislotasynyň has jikme-jik häsiýetlendirilmegi urbenon kislotasynyň hereket mehanizmine has gowy düşünmäge kömek eder.Hususan-da, indiki maksat urson kislotasynyň peselýän mikrotubulalara baglanmak ukybyna baha bermek, urson kislotasynyň we olardan emele gelenleriň göni mikrotubulalarda hereket edýändigini ýa-da depolimerizasiýa edýändigini ýa-da hereketleriniň mikrotubulalaryň durnuksyzlaşmagyna sebäp bolýandygyny kesgitlemekdir.Mundan başga-da, mikrotubulalar gönüden-göni nyşana alynmadyk ýagdaýynda, ösümlik öýjüklerindäki urson kislotasynyň hereket edýän ýerini we molekulýar nyşanlaryny kesgitlemek, baglanyşykly birleşmeleriň häsiýetlerine we gerbisid işjeňligini gowulandyrmagyň mümkin usullaryna has gowy düşünmäge kömek eder.Bioaktiwlik barlagymyz, Arabidopsis taliana, temmäki we bagyr keseli ýaly ösümlikleriň ösmegine urson kislotasynyň özboluşly sitotoksiki ukybyny ýüze çykardy, ýöne E. coli ýa-da HeLa öýjükleri täsir etmedi.Haýwan öýjüklerine az zäherlenme, açyk oba hojalygynda ulanmak üçin gerbisid hökmünde ösdürilse, urson kislotasynyň emele gelmeginiň artykmaçlygydyr.Hakykatdanam, mikrotubulalar eukariotlarda umumy gurluş bolansoň, ösümliklerde olaryň saýlanyp alynmagy gerbisidler üçin esasy talapdyr.Mysal üçin, tubuline gönüden-göni baglanýan we polimerizasiýany saklaýan mikrotubula depolimerleýji serişdesi bolan propyzamid, haýwan öýjüklerine az zäherliligi sebäpli gerbisid hökmünde ulanylýar24.Disopiramidden tapawutlylykda, baglanyşykly benzamidleriň dürli maksatly aýratynlyklary bar.Ösümlik mikrotubulalaryndan başga-da, RH-4032 ýa-da benzoksamid, degişlilikde haýwan öýjükleriniň ýa-da oomisetleriň mikrotubulalaryny saklaýar we zalilamid pes fitotoksikligi sebäpli fungisid hökmünde ulanylýar25,26,27.Täze açylan aýy we olardan emele gelenler ösümliklere garşy saýlama sitotoksikligi görkezýär, ýöne bellemeli zat, mundan beýläkki üýtgetmeler maksatly aýratynlygy üýtgedip biler, patogen kömeleklere ýa-da oomisetlere gözegçilik etmek üçin goşmaça emele getirip biler.
Urbenon turşusynyň we ondan emele gelen aýratynlyklaryň gerbisidler hökmünde ösmegi we gözleg gurallary hökmünde ulanylmagy üçin peýdalydyr.Sitoskeletiň ösümlik öýjükleriniň görnüşine gözegçilik etmekdäki ähmiýeti giňden ykrar edilýär.Öňki gözlegler ösümlikleriň morfogenezini dogry dolandyrmak üçin mikrotubula dinamikasyna gözegçilik edip, kortikal mikrotubula guramasynyň çylşyrymly mehanizmlerini ösdürendigini görkezdi.Mikrotubula işjeňligini kadalaşdyrmak üçin jogapkär köp sanly molekulalar kesgitlenildi we baglanyşykly gözlegler henizem dowam edýär3,4,28.Ösümlik öýjüklerindäki mikrotubula dinamikasyna häzirki düşünişimiz, kortikal mikrotubula guramasynyň mehanizmlerini doly düşündirip bilenok.Mysal üçin, disopiramid hem, oryzalin hem mikrotubulary depolimerleşdirip bilse-de, disopiramid köküň ýoýulmagyna sebäp bolýar, oryzalin bolsa birneme ýeňil täsir edýär.Mundan başga-da, mikrotubulary durnuklaşdyrýan tubulindäki mutasiýa, köklerde dektrorotasiýa sebäp bolýar, mikrotubula dinamikasyny durnuklaşdyrýan paklitaksel hem ýok.Şonuň üçin ursolik kislotanyň molekulýar nyşanlaryny öwrenmek we kesgitlemek ösümlik kortikal mikrotubulalaryny kadalaşdyrmak barada täze düşünjeleri bermeli.Edil şonuň ýaly-da, disopiramid ýaly ýoýulan ösüşi we orizalin ýa-da kumamotor kislotasy ýaly az täsirli himiki maddalary geljekde deňeşdirmek, ösüşiň nädogry ýüze çykýandygyny görkezer.
Beýleki tarapdan, goranyş bilen baglanyşykly sitoskelet düzedişleri urson kislotasynyň sitotoksikligini düşündirmek üçin başga bir mümkinçilikdir.Patogeniň ýokaşmagy ýa-da ösümlik öýjüklerine elitoryň girizilmegi käwagt sitoskeletiň ýok edilmegine we öýjükleriň ölmegine sebäp bolýar29.Mysal üçin, oomisetden alnan kriptoksantiniň temmäki öýjüginiň ölmezinden ozal mikrotubulalary we aktin filamentlerini bozýandygy habar berildi, KAND bejergisinde bolşy ýaly 30,31.Goranyş jogaplary bilen urson kislotasy bilen öýjükli jogaplaryň arasyndaky meňzeşlikler, umumy öýjükli prosesleri döredýär diýip çaklamaga sebäp boldy, ýöne urson kislotasynyň kriptoksantinden has çalt we güýçli täsiri görnüp dur.Şeýle-de bolsa, gözlegler aktin filamentleriniň bozulmagynyň öz-özünden öýjügiň ölmegine kömek edýändigini görkezdi, bu mydama mikrotubulalaryň bozulmagy bilen bilelikde bolmaýar29.Mundan başga-da, urson kislotasynyň emele gelşi ýaly, patogeniň ýa-da elitoryň köküň ösmegine sebäp bolýandygyna entek göz ýetirmeli.Şeýlelik bilen, goranyş jogaplaryny we sitoskeleti baglanyşdyrýan molekulýar bilimler çözülmeli özüne çekiji mesele.Urson kislotasy bilen baglanyşykly pes molekulaly agram birleşmeleriniň, şeýle hem dürli güýji bolan emele gelenleriň bir toparyny ulanmak bilen, näbelli öýjükli mehanizmleri nyşana almaga mümkinçilik döredip bilerler.
Bilelikde jemlenip, mikrotubula dinamikasyny modullaýan täze birleşmeleriň tapylmagy we ulanylmagy ösümlik öýjükleriniň görnüşini kesgitlemegiň esasy çylşyrymly molekulýar mehanizmleri çözmegiň güýçli usullaryny üpjün eder.Bu nukdaýnazardan, mikrotubulalara we aktin filamentlerine täsir edýän we öýjükleriň ölmegine sebäp bolýan ýaňy-ýakynda döredilen birleşýän urmoton turşusy, mikrotubula gözegçilik bilen beýleki mehanizmleriň arasyndaky baglanyşygy kesgitlemäge mümkinçilik döredip biler.Şeýlelik bilen, urbenon kislotasyny ulanmak bilen himiki we biologiki derňew ösümlik sitoskeletine gözegçilik edýän molekulýar kadalaşdyryjy mehanizmlere düşünmäge kömek eder.
S. werraensis MK493-CF1, 2% (w / v) galaktoza, 2% (w / v) Essensiýa pastasy, 1% (w / v) Bakto kompozisiýasyndan ybarat 110 ml tohum serişdesini öz içine alýan 500 ml garylan Erlenmeýer flakasyna sanjym ediň. .-soýton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w / v) mekgejöwen ekstrakty (KOGOSTCH Co., Ltd., Japanaponiýa), 0,2% (w / v) (NH4) 2SO4 we deionlaşdyrylan suwda 0,2% CaCO3.(sterilizasiýa etmezden öň pH 7.4).Tohum medeniýeti 27 günüň dowamynda 27 günüň dowamynda aýlanýan şekerde (180 aýlaw) inkubasiýa edildi.Gaty döwlet fermentasiýasy arkaly önümçilik ösdürip ýetişdirmek.Tohum medeniýeti (7 ml), 15 gr basylan arpadan (MUSO Co., Ltd., Japanaponiýa) we 25 g deionizirlenen suwdan (40 pH) düzedilmedik 40 g önümçilik gurşawyny öz içine alýan 500 ml K-1 flakana geçirildi. sterilizasiýa etmezden ozal).).Fermentasiýa 14 günüň dowamynda garaňkyda 30 ° C-de geçirildi.Fermentasiýa materialy 40 ml / çüýşe EtOH bilen alyndy we merkezden gaçyryldy (1500 g, 4 ° C, 10 min).Medeniýet adatdan daşary tebigaty (60 ml) 10% MeOH / EtOAc garyndysy bilen alyndy.Organiki gatlak ters faza sütüninde (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) galyndy (59-10 mg) almak üçin pes basyşda bugardy. 10 mm × uzynlygy 250 mm) H2O / CH3CN, 10–35 minut: 90% H2O / CH3CN-den 70% H2O / CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90% H2O / EtOH, 45-155 minut: 90% H2O / EtOH-dan 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) 1,5 ml / min akym tizliginde kumamonamid (1, 36.0 mg) ak amorf tozy hökmünde izolirlendi.
Kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MGts, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4.08 (lar, 3H);13C-NMR (125 MGts, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M + H] +: [C6H9N2O2] + hasaplanan bahasy: 141.0659, ölçenen bahasy: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 sm - 1.
Kolumbiýa tohumlary (Col-0) Arabidopsis Biologiki Resurs Merkezinden (ABRC) gözleg üçin rugsat almak bilen alyndy.Kol-0 tohumlary laboratoriýa şertlerimizde köpeldi we saklandy we ýabany görnüşli Arabidopsis ösümlikleri hökmünde ulanyldy.Arabidopsis tohumlary 2% sukroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w / v) 2- (4-morfolino) etanesulfon kislotasy (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) bolan ýarym güýçli Muraşige we Skoog gurşawynda sterilizasiýa edildi we ösdürilip ýetişdirildi. ).) we 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23 ° C we hemişelik ýagtylykda.Phs1-1 mutantyň tohumlaryny T. Haşimoto (Nara Ylym we Tehnologiýa Instituty) üpjün etdi.
SR-1 ştammynyň tohumlary T. Haşimoto (Nara Ylym we Tehnologiýa Instituty) tarapyndan üpjün edildi we ýabany görnüşli temmäki ösümlikleri hökmünde ulanyldy.Temmäki tohumlary sterilizasiýa edildi we gögerijiligini ýokarlandyrmak üçin üç gije steril suwa batyryldy, soňra 2% sukroz, 0.05% (w / v) MES we 0,8% gellan sakgyjy (Fujifilm Wako Pure Chemical) bolan ýarym güýçli ergine ýerleşdirildi. Murashige.we Skoog orta) pH 5.7 bilen we hemişelik ýagtylykda 23 ° C inkubasiýa edilýär.
“Strain Tak-1” T.Kohçi (Kýoto uniwersiteti) tarapyndan üpjün edildi we bagyr keselini öwrenmek üçin adaty synag bölümi hökmünde ulanyldy.Gemma sterilizasiýa edilen ösümliklerden alyndy we soňra 1% sukrozany we 0,3% gellan sakgyjyny öz içine alýan Gamborg B5 orta (Fujifilm Wako Pure Chemical) bilen örtüldi we üznüksiz ýagtylykda 23 ° C inkubasiýa edildi.
Temmäki BY-2 öýjükleri (Nicotiana tabacum L. cv. Açyk sary 2) S. Hasezawa (Tokio uniwersiteti) tarapyndan üpjün edildi.BY-2 öýjükleri üýtgedilen Linsmeier we Skoog gurşawynda 95 esse suwuklandyryldy we hepdede 2,4-dihlorofenoksiýasetik kislota 32 bilen dolduryldy.Öýjügiň asmagy, garaňkyda 27 ° C-de 130 aýlawda aýlanýan şeker bilen garyndy.Öýjükleri täze gurşawyň göwrüminden 10 esse ýuwuň we şol bir gurşawda gaýtadan ulanyň.Mikrotubula markerini TagRFP-TUA6 ýa-da karam mozaika wirusy 35S promouteriniň aşagyndaky aktin filament markeri GFP-ABD2 bilen durnukly aňladýan BY-2 transgen öýjük çyzyklary, 33,34,35 beýan edilişi ýaly döredildi.Bu öýjük çyzyklary asyl BY-2 öýjük çyzygy üçin ulanylýan proseduralary ulanyp saklanyp we sinhronlaşdyrylyp bilner.
HeLa öýjükleri Dulbecco-nyň üýtgedilen Bürgüt orta (DMEM) (10% düwünçegi), 1,2 U / ml penisillin we 5 ° CO2 bolan 37 ° C inkubatorda 1,2 μg / ml streptomisin bilen doldurylan Dulbecco-nyň üýtgedilen Bürgüt gurşawynda ösdürilip ýetişdirildi.
Bu golýazmada beýan edilen ähli synaglar Japaneseaponiýanyň biosfera howpsuzlygy düzgünlerine we görkezmelerine laýyklykda geçirildi.
Birleşmeler dimetil sulfoksidde (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) aksiýa ergini hökmünde eräp, Arabidopsis we temmäki ýa-da bagyrgort üçin Gamborg B5 serişdesi üçin MS gurşawynda eritildi.Kök ösmeginiň gadagan edilmegi üçin, görkezilen birleşmeleri ýa-da DMSO öz içine alýan agar gurşawyna her tabakda 10-dan gowrak tohum ekildi.Tohumlar 7 gün ösümlik kamerasynda saklandy.Fidanlar surata alyndy we kökleriniň uzynlygy ölçeldi.“Arabidopsis” gögeriş barlagy üçin, 200 μM birleşme ýa-da DMSO bolan agar gurşawyna bir tabak üçin 48 tohum ekildi.Arabidopsis tohumlary ösüş kamerasynda ösdürilip ýetişdirildi we gögeren nahallaryň sany gögerenden 7 gün soň sanaldy.Temmäki gögerijiligini öwrenmek üçin, 200 μM KAND ýa-da DMSO bolan agar gurşawyna bir tabak üçin 24 tohum ekildi.Temmäki tohumlary ösüş kamerasynda ösdürilip ýetişdirildi we gögeren nahallaryň sany 14 günden soň sanaldy.Bagyr ösümliginiň ösüşini gadagan etmek barlagy üçin, her tabakdan 9 düwünçek, KAND ýa-da DMSO görkezilen konsentrasiýalaryny öz içine alýan agar gurşawyna örtüldi we 14 gün ösüş kamerasynda saklandy.
Kök meristem guramasyny göz öňüne getirmek üçin 5 mg / ml propidium ýod (PI) bilen reňklenen nahallary ulanyň.PI signallary TCS SPE konokok lazer gözleýän mikroskopy (Leica Microsystems) ulanyp, floresan mikroskopiýasy bilen syn edildi.
Ro-glýukuronidaza (GUS) kökleriň gistohimiki boýagy Malami we Benfey36 tarapyndan beýan edilen teswirnama laýyklykda geçirildi.Tohumlar bir gije 90% asetonda düzüldi, 0,5 mg / ml 5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-d-glýukuron kislotasy bilen GUS buferinde 1 sagat boýaldy we gidratlanan hloraldegid erginine ýerleşdirildi.(8 g hlor gidrat, 2 ml suw we 1 ml gliserol) we Axio Imager M1 mikroskopyny (Karl Zeiss) ulanyp, diferensial päsgelçilik kontrast mikroskopiýasy bilen syn edilýär.
Kök burçlary dikligine ýerleşdirilen tabaklarda ösdürilip ýetişdirilen 7 günlük nahallarda ölçeldi.Kök burçuny 6-njy ädimde görkezilişi ýaly agyrlyk wektorynyň ugrundan ölçäň.
Kortikal mikrotubulalaryň tertibi, 37-nji protokola ownuk üýtgeşmeler girizilişi ýaly beýan edildi.Anti-tubuline garşy antikor (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) we Alexa Fluor 488-konýugirlenen syçanjyga garşy IgG (Termo Fisher Scientific: A32723) 1: 1000 we 1: 100 erginlerinde esasy we ikinji derejeli antikor hökmünde ulanyldy, degişlilikdeFloresan şekilleri TCS SPE konokok lazer gözleýän mikroskop (Leica Microsystems) arkaly alyndy.Z-stack şekilleri alyň we öndürijiniň görkezmesine laýyklykda iň ýokary intensiwlik çaklamalaryny dörediň.
HeLa öýjükleriň köpelmegi barlagy öndürijiniň görkezmesine laýyklykda öýjük sanamak toplumy 8 (Dojindo) ulanylyp geçirildi.
E. coli DH5α ösüşi 600 nm (OD600) spektrofotometr ulanyp, medeniýetdäki öýjük dykyzlygyny ölçemek arkaly derňeldi.
Transgen BY-2 öýjüklerindäki öýjük-skelet guramasy, CSU-X1 konokok skaner enjamy (okokogawa) we sCMOS kamerasy (Zyla, Andor Technology) bilen enjamlaşdyrylan floresan mikroskop arkaly syn edildi.Sitoskelet dykyzlygy şekil analizi bilen bahalandyryldy, 38,39 görkezilişi ýaly ImageJ programma üpjünçiligini ulanyp, konokok şekillerdäki sitoplazmatik pikselleriň arasynda sitoskelet pikselleriniň göterimini kesgitleýän şekil analizi bilen baha berildi.
BY-2 öýjüklerinde öýjügiň ölümini anyklamak üçin, öýjügiň asma alikoty, otag temperaturasynda 10 minut 0.05% Evans gök bilen inkubasiýa edildi.Öli öýjükleriň gök reňkli boýagy, boýagyň ýaşaýyş öýjüklerinden üznüksiz plazma membranasy bilen ekstruziýasyna baglydyr40.Dokalanan öýjükler açyk meýdan mikroskopy (BX53, Olympus) ulanylyp syn edildi.
HeLa öýjükleri 37 ° C we 5% CO2 çygly inkubatorda 10% FBS bilen doldurylan DMEM-de ösdürilip ýetişdirildi.Öýjükler 100 μM KAND 11, kumamonamik kislotasy 6, kumamonamid 1, 100 ng / ml kolsemid (Gibco) ýa-da 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) bilen 37 ° C-de 6 sagatda bejerildi.Öýjükler MetOH bilen 10 minut, soň bolsa otag temperaturasynda 5 minut asetat bilen düzedildi.Kesgitlenen öýjükler 0,5% BSA / PBS-de 2 sagat suwuklandyrylan β-tubulin başlangyç antikor (1D4A4, Proteintech: 66240-1) bilen inkubasiýa edildi, TBST bilen 3 gezek ýuwuldy, soň bolsa Alexa Fluor geçi antikor bilen inkubasiýa edildi.488 1 sagat.- Syçan IgG (Termo Fisher Scientific: A11001) we 15 ng / ml 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 0,5% BSA / PBS-de garyndy.TBST bilen üç gezek ýuwlandan soň, Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskopda reňkli öýjükler syn edildi.Suratlar MetaMorph programma üpjünçiligini (Molekulýar enjamlar) ulanyp, sowadylan Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerasy bilen düşürildi.
Iş wagty: Iýun-17-2024