Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS goldawy çäkli. Iň gowy netijeler üçin brauzeriňiziň täze wersiýasyny ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stilizasiýasyz ýa-da JavaScript-siz görkezýäris.
Tebigy önümleriň açylmagy we peýdaly ulanylyşy adam durmuşyny gowulandyrmaga kömek edip biler. Ösümlikleriň ösüşini togtadýan himiki maddalar haşal otlara garşy göreşmek üçin gerbisidler hökmünde giňden ulanylýar. Herbisidleriň dürli görnüşlerini ulanmagyň zerurlygy sebäpli, täze täsir mehanizmleri bolan birleşmeleri anyklamak zerurlygy ýüze çykýar. Bu gözlegde biz Streptomyces werraensis MK493-CF1-den täze N-alkoksipirrol birleşmesini, kumamonamid tapdyk we doly sintez prosesini döretdik. Biologiki işjeňlik synaglary arkaly biz urs-monoamid turşusynyň urs-monoamidiň sintetiki ara önümi we potensial...ösümlik ösüş inhibitoryMundan başga-da, biz dürli urbenon turşusynyň töremelerini, şol sanda HeLa öýjükleriniň ösüşine ýaramaz täsir etmezden, ýokary gerbisid işjeňligine eýe bolan urbeniloksi töremesini (UDA) işläp düzdik. Şeýle hem, urmoton turşusynyň töremeleriniň ösümlik mikrotubulalaryny bozýandygyny anykladyk; mundan başga-da, KAND aktin filamentlerine täsir edýär we öýjükleriň ölümine sebäp bolýar; Bu köpugurly täsirler belli mikrotubula ingibitorlaryndan tapawutlanýar we urson turşusynyň täze täsir mehanizmini görkezýär, bu bolsa täze gerbisidleriň işlenip düzülmeginde möhüm artykmaçlygy aňladýar.
Peýdaly tebigy önümleriň we olaryň öndürilişleriniň açylmagy we amaly ulanylyşy adam durmuşynyň hilini ýokarlandyrmagyň serişdesidir. Mikroorganizmler, ösümlikler we mör-möjekler tarapyndan öndürilýän ikinji metabolitler lukmançylykda we oba hojalygynda uly ösüşlere getirdi. Tebigy önümlerden köp sanly antibiotikler we leýkemiýa garşy dermanlar işlenip düzüldi. Mundan başga-da, dürli görnüşlipestisidler, fungisidler we gerbisidler oba hojalygynda ulanmak üçin bu tebigy önümlerden alynýar. Hususan-da, haşal otlara garşy göreşýän gerbisidler häzirki zaman oba hojalygynda ekinleriň hasyllylygyny ýokarlandyrmak üçin möhüm gurallardyr we dürli görnüşli birleşmeler eýýäm täjirçilik taýdan ulanylýar. Ösümliklerdäki fotosintez, aminokislota metabolizmi, öýjük diwarynyň sintezi, mitozyň düzgünleşdirilmegi, fitohormon signallaşdyrmasy ýa-da belok sintezi ýaly birnäçe öýjük prosesleri gerbisidleriň tipik nyşanalary hasaplanýar. Mikrotubulalaryň funksiýasyny bökdeýän birleşmeler mitotik düzgünleşdirmä täsir edip, ösümlikleriň ösüşine täsir edýän gerbisidleriň umumy synpydyr2.
Mikrotubulalar sitoskeletiň bölekleri bolup, eukariot öýjüklerinde giňden saklanýar. Tubulin geterodimeri α-tubulin we β-tubulinden ybarat bolup, çyzykly mikrotubula protofilamentlerini emele getirýär, 13 protofilament bolsa silindrik gurluş emele getirýär. Mikrotubulalar ösümlik öýjüklerinde öýjük görnüşini, öýjük bölünişini we öýjük içi daşamagy kesgitlemek ýaly köp sanly rol oýnaýar3,4. Ösümlik öýjüklerinde interfaza plazma membranasynyň aşagynda mikrotubulalar bar we bu kortikal mikrotubulalar diýlip atlandyrylýanlaryň sellýuloza sintaza kompleksleriniň düzgünleşdirilmegi arkaly sellýuloza mikrofibrilleriniň gurluşyny dolandyrýandygy çak edilýär4,5. Kök ujunyň çalt uzalýan zolagynda ýerleşýän kök epidermal öýjükleriniň kortikal mikrotubulalary gapdaldan ýerleşýär we sellýuloza mikrofiberleri bu mikrotubulalary yzarlaýar we öýjük giňelmeginiň ugruny çäklendirýär, şeýlelik bilen anizotrop öýjük uzalmagyna ýardam edýär. Şonuň üçin mikrotubulalaryň işi ösümlik morfologiýasy bilen ýakyndan baglanyşyklydyr. Tubulini kodlaýan genlerdäki aminokislotalaryň çalşylmagy Arabidopsisde kortikal mikrotubulalaryň gyşarnygyna we çep ýa-da sag taraplaýyn ösüşe sebäp bolýar 6,7. Şonuň ýaly-da, mikrotubulalaryň dinamikasyny düzgünleşdirýän mikrotubulalar bilen baglanyşykly beloklardaky mutasiýalar kök ösüşiniň bozulmagyna hem sebäp bolup biler8,9,10,11,12,13. Mundan başga-da, pretilahlor diýlip hem atlandyrylýan disopiramid ýaly mikrotubulalary bozýan gerbisidler bilen bejermek hem çep taraplaýyn oblik kök ösüşine sebäp bolýar14. Bu maglumatlar mikrotubulalaryň işiniň takyk düzgünleşdirilmeginiň ösümlik ösüşiniň ugruny kesgitlemek üçin möhümdigini görkezýär.
Mikrotubulalaryň ingibitorlarynyň dürli görnüşleri açyldy we bu dermanlar sitoskelet barlaglaryna, şeýle hem oba hojalygyna we lukmançylykda uly goşant goşdy2. Hususan-da, oryzalin, dinitroanilin birleşmeleri, disopiramid, benzamide degişli birleşmeler we olaryň analoglary mikrotubulalaryň funksiýasyny basyp, şonuň bilen ösümlikleriň ösüşini basyp bilýär. Şonuň üçin olar gerbisid hökmünde giňden ulanylýar. Şeýle-de bolsa, mikrotubulalar ösümlik we haýwan öýjükleriniň möhüm bölegi bolany üçin, mikrotubulalaryň ingibitorlarynyň köpüsi öýjükleriň iki görnüşi üçin hem sitotoksikdir. Şonuň üçin, gerbisid hökmünde ykrar edilen peýdalylygyna garamazdan, amaly maksatlar üçin çäkli sanly antimikrotubula serişdeleri ulanylýar.
Streptomyces, aerob, gram-pozitiw, filamentli bakteriýalary öz içine alýan we Streptomyces maşgalasynyň bir urugydyr we dürli ikinji metabolitleri öndürmek ukyby bilen giňden tanalýar. Şonuň üçin ol täze biologiki taýdan işjeň tebigy önümleriň iň möhüm çeşmeleriniň biri hasaplanýar. Häzirki gözlegde biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 we S. werraensis ISP 5486-dan bölünip alnan kumamonamid atly täze birleşme tapdyk. Spektral analiz we doly spektral analiz ulanylyp, kumamonamidiň gurluşy häsiýetlendirildi we onuň özboluşly N-alkoksipirrol skeleti kesgitlendi. sintez. Urmon turşusy, urmonamid we onuň törämeleriniň sintetiki ara önümi, meşhur model ösümligi Arabidopsis thaliana-nyň ösüşini we ösmegini togtatýandygy anyklandy. Gurluş-aktiwlik gatnaşygyny öwrenmekde, urson turşusyna üýtgedilen C9 bolan urson turşusynyň noniloksi törämesi (KAND) diýlip atlandyrylýan birleşmesiniň ösüşe we ösmegine togtatyjy täsirini ep-esli güýçlendirýändigini anykladyk. Belli bir zat, täze açylan ösümlik ösüş ingibitory temmäkiniň we bagyr otunyň ösüşine hem täsir etdi we bakteriýalara ýa-da HeLa öýjüklerine sitotoksik däldi. Mundan başga-da, käbir urmoton turşusynyň törämeleri kök fenotipiniň bozulmagyna sebäp bolýar, bu bolsa bu törämeleriň gönüden-göni ýa-da gytaklaýyn mikrotubulalara täsir edýändigini aňladýar. Bu pikir bilen gabat gelýän bolsa-da, immunohistokimiki ýa-da fluoressent beloklar bilen belgilenen mikrotubulalara gözegçiliklerimiz KAND bejergisiniň mikrotubulalary depolimerleşdirýändigini görkezýär. Mundan başga-da, kumamoton turşusynyň törämeleri bilen bejergi aktin mikrofilamentlerini bozdy. Şeýlelik bilen, biz täsir ediş mehanizmi sitoskeletiň ýok edilmegi bilen baglanyşykly täze ösümlik ösüş ingibitory tapdyk.
Tokionyň Şinagawa-ku şäherinde toprakdan MK493-CF1 ştammy bölünip alyndy. MK493-CF1 ştammy gowy şahalanan stromal miseliý emele getirdi. 16S ribosomal RNK geniniň bölekleýin yzygiderliligi (1422 bp) kesgitlenildi. Bu ştamm S. werraensis-e örän meňzeş (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipiki ştamm, 99.93%). Bu netijä esaslanyp, bu ştammyň S. werraensis-iň ştamm görnüşine ýakyndygy anyklandy. Şonuň üçin biz bu ştammy wagtlaýynça S. werraensis MK493-CF1 diýip atlandyrdyk. S. werraensis ISP 5486T hem şol bir bioaktiw birleşmeleri öndürýär. Bu mikroorganizmden tebigy önümleri almak boýunça irki barlaglar az bolandygy sebäpli, goşmaça himiki barlaglar geçirildi. S. werraensis MK493-CF1 arpa ortamynda 30°C-da 14 günläp gaty ýagdaýda fermentasiýa arkaly ösdürilip ýetişdirilenden soň, ortam 50% EtOH bilen ekstraksiýa edildi. 59,5 mg çig ekstrakt almak üçin 60 ml nusga guradyldy. Çig ekstrakt N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid (1, kumamonamid diýlip atlandyrylýar, 36,0 mg) almak üçin ters fazaly HPLC-e sezewar edildi. 1-iň umumy mukdary çig ekstraktyň takmynan 60% -ini düzýär. Şonuň üçin biz kumamotoamidiň 1 häsiýetlerini jikme-jik öwrenmegi makul bildik.
Kumamonamid 1 ak amorf poroşokdyr we ýokary çözgütli massa spektrometriýasy (HRESIMS) C6H8N2O2-ni tassyklaýar (1-nji surat). Bu birleşmäniň C2 bilen çalşyrylan pirrol bölegi δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR spektrinde: 4.5 Hz, H-5) we δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) bilen häsiýetlendirilýär we 13C NMR spektri dört sp2 uglerod atomunyň bardygyny görkezýär. C2 pozisiýasynda amid toparynyň bolmagy δC 161.1-de C-3 protonundan amid karbonil uglerodyna HMBC korrelýasiýasy arkaly bahalandyryldy. Mundan başga-da, δH 4.10 (3H, S) we δC 68.3-de 1 H we 13C NMR pikleri molekulada N-metoksi toparlarynyň bardygyny görkezýär. Metoksi toparynyň dogry ýerleşýän ýeri heniz spektroskopiki analiz, mysal üçin güýçlendirilen tapawut spektroskopiýasy we ýadro Overhauser gysgaltmasy (NOEDF) arkaly kesgitlenmedik bolsa-da, N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid ilkinji dalaşgär birleşme boldy.
1-iň dogry gurluşyny kesgitlemek üçin umumy sintez geçirildi (2a-njy surat). Söwda taýdan elýeterli 2-aminopiridin 2-niň m-CPBA bilen işlenilmegi mukdar taýdan degişli N-oksid 3-e getirdi. 2-niň 2-aminoazidleşdirilmeginden soň, Abramowiçiň beýan eden siklokondensasiýa reaksiýasy 90°C-da benzolda geçirilip, islenýän 1-gidroksi-1H-pirrol-2-karbonitril 5 grammda alyndy. Tizlik 60% (iki tapgyr). 15,16. Soňra 4-iň metilleşdirilmegi we gidrolizi gowy netijede (70%, iki tapgyr) 1-metoksi-1H-pirrol-2-karbon turşusyny ("kumoton turşusy" diýlip atlandyrylýar, 6) berdi. Ahyrsoňy, suwly ammiak ulanyp, kislota hlorid aralyk önümi 6 arkaly amidleşdirme Kumamoto amid 1-i 98% netijede berdi. Sintezlenen 1-iň ähli spektral maglumatlary izolýasiýa edilen 1-e meňzeşdi, şonuň üçin 1-iň gurluşy kesgitlenildi;
Urbenamid we urben turşusynyň biologik işjeňliginiň umumy sintezi we seljermesi. (a) Kumamoto amidiniň umumy sintezi. (b) Ýedi günlük ýabany görnüşli Arabidopsis Columbia (Col) nahallary görkezilen konsentrasiýalarda kumamonamid 6 ýa-da kumamonamid 1 saklaýan Murashige we Skoog (MS) plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirildi. Ölçeg çyzygy = 1 sm.
Ilki bilen, biz urbenamidiň we onuň aralyk önümleriniň ösümlikleriň ösüşini sazlamak ukybyna görä biologik işjeňligini bahaladyk. Biz MS agar gurşawa dürli konsentrasiýaly urmonamid 1 ýa-da urmon turşusy 6 goşduk we bu gurşawda Arabidopsis thaliana nahallaryny ösdürdik. Bu barlaglar 6-nyň ýokary konsentrasiýalarynyň (500 μM) kökleriň ösüşine päsgel berýändigini görkezdi (2b-nji surat). Soňra, biz 6-nyň N1 pozisiýasyny çalşyp, dürli türewleri döretdik we olaryň üstünde gurluş-aktiwlik gatnaşygyny öwrendik (analog sintez prosesi Goşmaça Maglumatda (SI) beýan edilýär). Arabidopsis nahallary 50 μM urson turşusy türewlerini öz içine alýan gurşawda ösdürilip ýetişdirildi we kökleriň uzynlygy ölçeldi. Suratda görkezilişi ýaly. 3a, b we S1 suratlarynda görkezilişi ýaly, kumamo turşularynyň N1 pozisiýasynda dürli uzynlykdaky çyzykly alkoksi zynjyrlary (9, 10, 11, 12 we 13) ýa-da uly alkoksi zynjyrlary (15, 16 we 17) bar. Töremeler kökleriň ösüşiniň düýpli derejede saklanmagyny görkezdi. Mundan başga-da, biz 200 μM 10, 11 ýa-da 17-niň ulanylmagynyň ösüşe päsgel berýändigini anykladyk (3c we S2 suratlar).
Kumamoto amidiniň we degişli birleşmeleriň gurluş-aktiwlik gatnaşygyny öwrenmek. (a) Analoglaryň gurluşy we sintez shemasy. (b) 50 μM kumamonamid türewleri bilen ýa-da onsuz MS gurşawynda ösdürilip ýetişdirilen 7 günlük nahallaryň kök uzynlygynyň mukdaryny kesgitlemek. Ýyldyzlar ýalan bejergi bilen möhüm tapawutlary görkezýär (t synag, p<0.05). n>18. Maglumatlar ortaça ± SD hökmünde görkezilýär. nt "synagdan geçirilmedik" diýmegi aňladýar, sebäbi tohumlaryň 50% -den gowragy çişmedi. (c) MS gurşawynda 200 μM kumamonamid we degişli birleşmeler bilen ýa-da goşulmazdan 7 gün inkubasiýa edilen bejerilen tohumlaryň çişme tizliginiň mukdary. Ýyldyzlar ýalan bejergi bilen möhüm tapawutlary görkezýär (hi-kwadrat synagy). n=96.
Gyzykly tarapy, C9-dan uzyn alkil gapdal zynjyrlarynyň goşulmagy tormozlaýjy işjeňligi peseltdi, bu bolsa kumamoot kislotasy bilen baglanyşykly birleşmeleriň biologik işjeňligini görkezmek üçin belli bir ululykdaky gapdal zynjyrlara mätäçdigini görkezýär.
Gurluş-aktiwlik gatnaşygynyň seljermesi C9-yň urson turşusyna üýtgedilendigini we urson turşusynyň noniloksi töremesiniň (mundan beýläk KAND 11 diýlip atlandyrylýar) ösümlik ösüşiniň iň täsirli ingibitory bolandygyny görkezendigi üçin, biz KAND 11-iň has jikme-jik häsiýetlendirmesini geçirdik. Arabidopsis-i 50 μM KAND 11 bilen bejermek, çişmegiň düýbünden öňüni aldy, KAND 11-iň pes konsentrasiýalary (40, 30, 20 ýa-da 10 μM) bolsa kökleriň ösüşini doza bagly görnüşde çäkledi (4a, b surat). KAND 11-iň kök meristemasynyň ýaşaýşa täsir edýändigini barlamak üçin, biz propidium ýodidi (PI) bilen boýalan kök meristemalaryny barladyk we meristema meýdanynyň ululygyny ölçedik. 25 μM KAND-11 saklaýan gurşawda ösdürilip ýetişdirilen nahallaryň meristemasynyň ululygy 151,1 ± 32,5 μm, DMSO saklaýan gözegçilik gurşawynda ösdürilip ýetişdirilen nahallaryň meristemasynyň ululygy bolsa 264,7 ± 30,8 μm boldy (4c, d surat), bu bolsa KAND-11-iň öýjük işjeňligini dikeldýändigini görkezýär. ýaýraýar. Kök meristemasy. Muňa laýyklykda, KAND 11 bejergisi kök meristemasyndaky öýjük bölüniş markeriniň CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signalynyň mukdaryny azaldy (4e surat) 17. Bu netijeler KAND 11-iň öýjükleriň köpelme işjeňligini azaltmak arkaly kökleriň ösüşini togtatýandygyny görkezýär.
Urbenon turşusynyň öndürilmeleriniň (urbeniloksi öndürilmeleriniň) ösüşe päsgel beriji täsiriniň seljermesi. (a) KAND 11-iň görkezilen konsentrasiýalary bilen MS plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirilen 7 günlük ýabany görnüşli Col nahallary. Ölçeg çyzygy = 1 sm. (b) Kök uzynlygynyň mukdary. Harplar möhüm tapawutlary görkezýär (Tukey HSD synagy, p<0.05). n>16. Maglumatlar ortaça ± SD hökmünde görkezilýär. (c) 25 μM KAND bilen ýa-da onsuz MS plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirilen propidiý ýodid bilen boýalan ýabany görnüşli Col kökleriniň konfokal mikroskopiýa 11. Ak ýaýlar kök meristemasyny görkezýär. Ölçeg çyzygy = 100 µm. (d) Kök meristemasynyň ululygynyň mukdaryny kesgitlemek (n = 10-dan 11-e çenli). Statistik tapawutlar t-test arkaly kesgitlenildi (p< 0.05). Çyzyklar meristemanyň ortaça ululygyny görkezýär. (e) CDKB2 gurluşyny öz içine alýan kök meristemasynyň differensial interferensiýa kontrastly (DIC) mikroskopiýasyny; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND synagy bilen ýa-da synagsyz MS plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirilen 5 günlük nahallarda 1-GUS boýalan we reňklenen.
KAND 11-iň fitotoksikligi başga bir iki palçykly ösümlik, temmäki (Nicotiana tabacum) we esasy gury ýer ösümlikleriniň model organizmi, bagyr otuny (Marchantia polymorpha) ulanylyp has-da synagdan geçirildi. Arabidopsis ýagdaýynda bolşy ýaly, 25 μM KAND 11 saklaýan gurşawda ösdürilip ýetişdirilen temmäki SR-1 nahallary has gysga kökleri döretdi (5a-njy surat). Mundan başga-da, 48 tohumyň 40-sy 200 μM KAND 11 saklaýan tarelkalarda ösüp çykdy, 48 tohumyň hemmesi bolsa gaýtadan işlenen gurşawlarda ösüp çykdy, bu bolsa KAND-iň ýokary konsentrasiýalarynyň möhümdigini görkezýär (p).<0.05; chi synagy -kwadrat) temmäkiniň ösüp çykmagyna päsgel berdi. (5b-nji surat). Mundan başga-da, bagyr otunda bakteriýalaryň ösmegine päsgel beren KAND 11-iň konsentrasiýasy Arabidopsisdäki netijeli konsentrasiýa meňzeşdi (5c-nji surat). Bu netijeler KAND 11-iň dürli ösümlikleriň ösüşini basyp biljekdigini görkezýär. Soňra biz beýleki organizmlerde, ýagny adam HeLa öýjüklerinde we Escherichia coli ştammy DH5α-da aýy monoamid bilen baglanyşykly birleşmeleriň mümkin bolan sitotoksikligini, degişlilikde ýokary haýwan we bakteriýa öýjükleriniň wekilleri hökmünde öwrendik. Öýjükleriň köpelmegi boýunça birnäçe synaglarda biz kumamonamid 1, kumamonamid turşusy 6 we KAND 11-iň 100 μM konsentrasiýalarda HeLa ýa-da E. coli öýjükleriniň ösüşine täsir etmeýändigini gördük (5d,e-nji surat).
Arabidopsis däl organizmlerde KAND 11-iň ösüşiniň basylyp saklanmagy. (a) Iki hepdelik ýabany görnüşli SR-1 temmäki nahallary 25 μM KAND 11 saklaýan dik ýerleşdirilen MS plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirildi. (b) Iki hepdelik ýabany görnüşli SR-1 temmäki nahallary 200 μM KAND 11 saklaýan gorizontal ýerleşdirilen MS plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirildi. (c) KAND 11-iň görkezilen konsentrasiýalary bilen Gamborg B5 plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirilen iki hepdelik ýabany görnüşli Tak-1 bagyr ösümligi tumurcuklary. Gyzyl oklaryň görkezijileri iki hepdelik inkubasiýa döwründe ösmegini bes eden sporalary görkezýär. (d) HeLa öýjükleriniň öýjük köpeliş synagy. Ýaşaýyşly öýjükleriň sany öýjük sanaýyş toplumy 8 (Dojindo) ulanylyp, belli bir wagt aralyklarynda ölçeldi. Gözegçilik hökmünde HeLa öýjükleri RNK polimeraza transkripsiýasyny basyp, öýjükleriň ölümine sebäp bolýan 5 μg/ml aktinomisin D (D hereketi) bilen bejerildi. Analizler üç gezek geçirildi. (e) E. coli öýjük köpeliş synagy. E. coli-niň ösüşi OD600 ölçegi arkaly seljerildi. Gözegçilik hökmünde öýjüklere bakteriýa öýjük diwarynyň sintezini basyp saklaýan 50 μg/ml ampisillin (Amp) berildi. Analizler üç gezek geçirildi.
Uramid bilen baglanyşykly birleşmeleriň döredýän sitotoksikliginiň täsir mehanizmini düşündirmek üçin, suratda görkezilişi ýaly, ortaça tormozlaýjy täsirleri bolan urben turşusynyň töremelerini gaýtadan seljerdik. 2b, 6a suratlarda görkezilişi ýaly, urmoton turşusynyň ýokary konsentrasiýalaryny (200 μM) öz içine alýan agar plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirilen nahallar has gysga we çep egri kökleri öndürdi (θ = – 23.7 ± 6.1), gözegçilik gurşawynda ösdürilip ýetişdirilen nahallaryň bolsa, nahallar diýen ýaly göni kökleri öndürdi (θ = – 3.8 ± 7.1). Bu häsiýetli oblik ösüşi korteks mikrotubulalarynyň disfunksiýasyndan gelip çykýandygy mälim14,18. Bu netijä laýyklykda, mikrotubulalary durnuksyzlaşdyrýan disopiramid we oryzalin dermanlary ösüş şertlerimizde kökleriň meňzeş egriligine sebäp boldy (2b, 6a suratlar). Şol bir wagtyň özünde, urmoton turşusynyň töremelerini synagdan geçirdik we belli bir konsentrasiýalarda oblik kök ösüşini döreden olaryň birnäçesini saýladyk. 8, 9 we 15 birleşmeleri degişlilikde 75 μM, 50 μM we 40 μM-de kök ösüş ugruny üýtgetdi, bu bolsa bu birleşmeleriň mikrotubulalary netijeli durnuksyzlaşdyryp biljekdigini görkezýär (2b, 6a surat). Şeýle hem, iň güýçli ursolik turşusynyň töremesi bolan KAND 11-i pes konsentrasiýada (15 µM) synagdan geçirdik we KAND 11-iň ulanylmagynyň kök ösüşini bökdeýändigini we kök ösüş ugrunyň deň däldigini, emma olaryň çepe tarap egilýändigini anykladyk (C3 surat). Mikrotubulalary durnuksyzlaşdyrýan dermanlaryň ýokary konsentrasiýalary käwagt köküň egilmegine sebäp bolman, ösümlikleriň ösüşini bökdeýändigi sebäpli, soňra kök epidermal öýjüklerinde kortikal mikrotubulalary synlap, KAND 11-iň mikrotubulalara täsir etmeginiň mümkinçiligini bahaladyk. 25 μM KAND 11 bilen bejerilen şitil kökleriniň epidermal öýjüklerinde anti-β-tubulin antitelalaryny ulanyp immunohistokimiýa, uzalma zolagyndaky epidermal öýjüklerdäki ähli kortikal mikrotubulalaryň diýen ýaly ýok bolandygyny görkezdi (6b-nji surat). Bu netijeler kumamoton turşusynyň we onuň törämeleriniň mikrotubulalara gönüden-göni ýa-da gytaklaýyn täsir edip, olary bozýandygyny we bu birleşmeleriň täze mikrotubula ingibitorlarydygyny görkezýär.
Urson turşusy we onuň törämeleri Arabidopsis thaliana-da kortikal mikrotubulalary üýtgedýär. (a) Görkezilen konsentrasiýalarda dürli urmoton turşusy törämeleriniň gatnaşmagynda ölçenen kök egiliş burçy. Mikrotubulalary basyp ýatyrýandygy mälim bolan iki birleşmäniň: disopiramid we oryzaliniň täsiri hem seljerildi. Goşulan suratda kök ösüş burçuny ölçemek üçin ulanylýan standart görkezilýär. Ýyldyzlar ýalan bejergi bilen möhüm tapawutlary görkezýär (t synag, p<0.05). n>19. Ölçeg çyzygy = 1 sm. (b) Uzalma zolagyndaky epidermal öýjüklerdäki kortikal mikrotubulalar. 25 μM KAND 11 bilen ýa-da onsuz MS plastinkalarynda ösdürilip ýetişdirilen ýabany görnüşli Arabidopsis Col köklerindäki mikrotubulalar β-tubulin ilkinji antitelalaryny we Alexa Fluor bilen birleşdirilen ikinji antitelalary ulanyp immunohistokimiki boýamak arkaly görkezildi. Ölçeg çyzygy = 10 μm. (c) Kök meristemasyndaky mikrotubulalaryň mitotik gurluşy. Mikrotubulalar immunohistokimiki boýamak arkaly görkezildi. Profaza zonalaryny, şpindelleri we fragmoplastlary öz içine alýan mitotik gurluşlar konfokal suratlardan sanaldy. Oklar mitotik mikrotubula gurluşlaryny görkezýär. Ýyldyzlar ýalan bejergi bilen möhüm tapawutlary görkezýär (t synag, p<0.05). n>9. Ölçeg çyzygy = 50 µm.
Ursa mikrotubulalaryň işini bozmak ukybyna eýe bolsa-da, onuň täsir ediş mehanizminiň adaty mikrotubulalaryň depolimerleşdiriji agentlerinden tapawutly bolmagyna garaşylýar. Mysal üçin, disopiramid we oryzalin ýaly mikrotubulalaryň depolimerleşdiriji agentleriniň ýokary konsentrasiýalary epidermal öýjükleriň anizotropik giňelmegine sebäp bolýar, KAND 11 bolsa beýle etmeýär. Mundan başga-da, KAND 11 we disopiramidiň bilelikde ulanylmagy disopiramid tarapyndan döredilen kök ösüş jogabyna we KAND 11 tarapyndan döredilen ösüşiň basylyp saklanmagyna getirdi (S4-nji surat). Şeýle hem, ýokary duýgur disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantynyň KAND 11-e bolan jogabyny seljerdik. phs1-1-iň kanonik däl tubulin kinaz nokadynyň mutasiýasyna eýe we disopiramid9,20 bilen işlenilende has gysga kökleri öndürýär. KAND 11 saklaýan agar gurşawynda ösdürilip ýetişdirilen phs1-1 mutant nahallary disopiramidde ösdürilip ýetişdirilenlere meňzeş has gysga köklere eýe boldy (S5-nji surat).
Mundan başga-da, biz KAND 11 bilen bejerilen şitilleriň kök meristemasynda profaza zonalary, şpilkalar we fragmoplastlar ýaly mitotik mikrotubula gurluşlaryny synladyk. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS üçin gözegçiliklere laýyklykda, mitotik mikrotubulalaryň sanynyň ep-esli azalandygy syn edildi (6c-nji surat).
KAND 11-iň subhüjre çözgüdinde sitotoksikligini häsiýetlendirmek üçin, biz temmäki BY-2 suspenziýa öýjüklerini KAND 11 bilen bejerdik we olaryň jogabyny synladyk. KAND 11-iň kortikal mikrotubulalara täsirini bahalandyrmak üçin ilki bilen mikrotubulalary flüoresans taýdan bellikleýän TagRFP-TUA6 ekspresirleýän BY-2 öýjüklerine KAND 11 goşduk. Kortikal mikrotubulalaryň dykyzlygy sitoplazmatik pikselleriň arasyndaky sitoskelet pikselleriniň göterimini kesgitleýän surat seljermesi arkaly bahalandyryldy. Synag netijeleri 50 μM ýa-da 100 μM KAND 11 bilen 1 sagatlap bejerilenden soň, dykyzlygyň degişlilikde 0,94 ± 0,74% ýa-da 0,23 ± 0,28% -e çenli ep-esli azalandygyny, DMSO bilen bejerilen öýjükleriň dykyzlygynyň bolsa 1,61 ± 0,34% -e deň bolandygyny görkezdi (7a-njy surat). Bu netijeler Arabidopsisde KAND 11 bejergisiniň kortikal mikrotubulalaryň depolimerleşmegine sebäp bolýandygy baradaky syn bilen gabat gelýär (6b-nji surat). Şeýle hem, KAND 11-iň şol bir konsentrasiýasy bilen bejergiden soň GFP-ABD belgili aktin filamentleri bilen BY-2 liniýasyny barladyk we KAND 11 bejergisiniň aktin filamentlerini bozandygyny gördük. 50 μM ýa-da 100 μM KAND 11 bilen 1 sagatlap bejergi aktin filamentiniň dykyzlygyny degişlilikde 1,20 ± 0,62% ýa-da 0,61 ± 0,26% -e çenli ep-esli azaltdy, DMSO bilen bejergi alnan öýjüklerdäki dykyzlyk bolsa 1,69 ± 0,51% boldy (2-nji surat). 7b). Bu netijeler aktin filamentlerine täsir etmeýän propizamidiň we mikrotubulalara täsir etmeýän aktin depolimerizatory bolan latrunkulin B-niň täsirleri bilen tapawutlanýar (SI S6-njy surat). Mundan başga-da, kumamonamid 1, kumamonamid turşusy 6 ýa-da KAND 11 bilen bejergi HeLa öýjüklerindäki mikrotubulalara täsir etmedi (SI S7 surat). Şeýlelik bilen, KAND 11-iň täsir ediş mehanizminiň belli sitoskelet bozujylaryndan tapawutlydygyna ynanylýar. Mundan başga-da, KAND 11 bilen bejergi alan BY-2 öýjükleriniň mikroskopiki gözegçiligimiz KAND 11 bejergisi wagtynda öýjük ölüminiň başlandygyny görkezdi we Evans gök reňkli ölü öýjükleriniň paýynyň KAND 11 bejergisiniň 30 minutyndan soň düýpli artmadygyny, 50 μM ýa-da 100 μM KAND bilen 90 minut bejergiden soň bolsa, ölü öýjükleriň sanynyň degişlilikde 43,7% ýa-da 80,1% -e çenli ýokarlanandygyny görkezdi (7c surat). Jemi alnanda, bu maglumatlar täze ursolik turşusynyň töremesi KAND 11-iň öň belli bolmadyk täsir ediş mehanizmi bolan ösümliklere mahsus sitoskelet ingibitorydygyny görkezýär.
KAND kortikal mikrotubulalara, aktin filamentlerine we temmäki BY-2 öýjükleriniň ýaşaýyş ukybyna täsir edýär. (a) TagRFP-TUA6-nyň gatnaşmagynda BY-2 öýjüklerinde kortikal mikrotubulalaryň wizualizasiýa edilmegi. KAND 11 (50 μM ýa-da 100 μM) ýa-da DMSO bilen bejerilen BY-2 öýjükleri konfokal mikroskopiýa arkaly barlandy. Kortikal mikrotubulalaryň dykyzlygy 25 garaşsyz öýjükleriň mikrografiýalaryndan hasaplandy. Harplar möhüm tapawutlary görkezýär (Tukey HSD synagy, p< 0.05). Ölçeg çyzygy = 10 µm. (b) GFP-ABD2-niň gatnaşmagynda BY-2 öýjüklerinde kortikal aktin filamentleri görkezildi. KAND 11 (50 μM ýa-da 100 μM) ýa-da DMSO bilen bejerilen BY-2 öýjükleri konfokal mikroskopiýa arkaly barlandy. Kortikal aktin filamentleriniň dykyzlygy 25 garaşsyz öýjükleriň mikrografiýalaryndan hasaplandy. Harplar möhüm tapawutlary görkezýär (Tukey HSD synagy, p< 0.05). Ölçeg çyzygy = 10 µm. (c) Öli BY-2 öýjükleriniň Ewans gök reňkli boýagy arkaly synlanmagy. KAND 11 (50 µM ýa-da 100 µM) ýa-da DMSO bilen işlenen BY-2 öýjükleri ýagty meýdanly mikroskopiýa arkaly barlandy. n=3. Ölçeg çyzygy = 100 µm.
Täze tebigy önümleriň açylmagy we ulanylmagy adam durmuşynyň dürli ugurlarynda, şol sanda lukmançylykda we oba hojalygynda uly öňegidişliklere getirdi. Tebigy serişdelerden peýdaly birleşmeleri almak üçin taryhy barlaglar geçirildi. Hususan-da, aktinomisetleriň nematodlar üçin parazitlere garşy antibiotik hökmünde peýdalydygy mälim, sebäbi olar dürli ikinji derejeli metabolitleri, mysal üçin, iwermektiniň we bleomisiniň we onuň töremelerini öndürmek ukybyna eýedirler, olar lukmançylykda rak garşy serişde hökmünde ulanylýar21,22. Şeýle hem, aktinomisetlerden dürli gerbisid birleşmeleri tapyldy, olaryň käbiri eýýäm täjirçilik taýdan ulanylýar1,23. Şonuň üçin, islenýän biologik işjeňligi bolan tebigy önümleri bölüp almak üçin aktinomiset metabolitlerini seljermek netijeli strategiýa hasaplanýar. Bu barlagda biz S. werraensis-den täze birleşme, kumamonamid tapdyk we ony üstünlikli sintezledik. Urson turşusy urbenamidiň we onuň töremeleriniň sintetiki ara önümidir. Ol kökleriň häsiýetli burulmagyna sebäp bolup biler, ortaça we güýçli gerbisid işjeňligini görkezip biler we ösümlik mikrotubulalaryna gönüden-göni ýa-da gytaklaýyn zyýan ýetirip biler. Şeýle-de bolsa, urmoton turşusynyň täsir ediş mehanizmi bar bolan mikrotubula ingibitorlaryndan tapawutlanyp biler, sebäbi KAND 11 aktin filamentlerini hem bozýar we öýjükleriň ölümine sebäp bolýar, bu bolsa urmoton turşusynyň we onuň törämeleriniň sitoskelet gurluşlarynyň giň gerimine täsir edýän düzgünleşdiriji mehanizmi görkezýär.
Urbenon turşusynyň has jikme-jik häsiýetlendirilmegi urbenon turşusynyň täsir mehanizmini has gowy düşünmäge kömek eder. Hususan-da, indiki maksat urson turşusynyň we onuň türewleriniň mikrotübüllere gönüden-göni täsir edip, olary depolimerleşdirýändigini ýa-da olaryň täsiriniň mikrotübülleriň durnuksyzlaşmagyna getirýändigini kesgitlemek üçin urson turşusynyň kiçeldilen mikrotübüllere baglanmak ukybyny bahalandyrmakdyr. Mundan başga-da, mikrotübüller gönüden-göni nyşana bolmadyk ýagdaýynda, urson turşusynyň ösümlik öýjüklerinde täsir edýän ýerini we molekulýar nyşanalaryny kesgitlemek baglanyşykly birleşmeleriň häsiýetlerini we gerbisid işjeňligini ýokarlandyrmagyň mümkin bolan usullaryny has gowy düşünmäge kömek eder. Bioaktiwlik synagymyz urson turşusynyň Arabidopsis thaliana, temmäki we bagyr otlary ýaly ösümlikleriň ösüşine özboluşly sitotoksik ukybyny ýüze çykardy, şol bir wagtyň özünde E. coli we HeLa öýjüklerine täsir edilmedi. Urson turşusynyň türewleri açyk oba hojalyk meýdanlarynda ulanmak üçin gerbisid hökmünde işlenip düzülse, haýwan öýjüklerine az zäherlilik täsir edýär ýa-da ýok. Hakykatdan-da, mikrotubulalar eukariotlarda umumy gurluşlar bolany üçin, olaryň ösümliklerde selektiw inhibisiýasy gerbisidler üçin esasy talapdyr. Mysal üçin, tubuline gönüden-göni baglanýan we polimerleşmegi basyp saklaýan mikrotubula depolimerleşdiriji agent bolan propizamid haýwan öýjüklerine pes zäherliligi sebäpli gerbisid hökmünde ulanylýar24. Disopiramidden tapawutlylykda, degişli benzamidler dürli nyşana aýratynlyklaryna eýedir. Ösümlik mikrotubulalaryndan başga-da, RH-4032 ýa-da benzoksamid degişlilikde haýwan öýjükleriniň ýa-da oomisetleriň mikrotubulalaryny hem basyp saklaýar we zalilamid pes fitotoksikligi sebäpli fungisid hökmünde ulanylýar25,26,27. Täze açylan aýy we onuň töremeleri ösümliklere garşy selektiw sitotoksiklik görkezýär, ýöne mundan beýläk üýtgetmeleriň olaryň nyşana aýratynlyklaryny üýtgedip biljekdigini, patogen kömelekleriň ýa-da oomisetleriň gözegçiligi üçin goşmaça töremeleri üpjün edip biljekdigini bellemek gerek.
Urbenon turşusynyň we onuň öndürilýän önümleriniň özboluşly häsiýetleri olaryň gerbisidler hökmünde işlenip düzülmegi we ylmy-barlag gurallary hökmünde ulanylmagy üçin peýdalydyr. Sitoskeletonyň ösümlik öýjükleriniň görnüşini gözegçilikde saklamagyň ähmiýeti giňden ykrar edilýär. Öňki barlaglar ösümlikleriň morfogenezi dogry gözegçilik etmek üçin mikrotübülleriň dinamikasyny gözegçilikde saklamak arkaly kortikal mikrotübülleriň gurluşynyň çylşyrymly mehanizmlerini ösdürendigini görkezdi. Mikrotübülleriň işjeňliginiň düzgünleşdirilmegine jogapkär bolan köp sanly molekulalar anyklandy we degişli barlaglar henizem dowam edýär3,4,28. Ösümlik öýjüklerinde mikrotübülleriň dinamikasy baradaky häzirki düşünjämiz kortikal mikrotübülleriň gurluşynyň mehanizmlerini doly düşündirmeýär. Mysal üçin, disopiramid hem, orizalin hem mikrotübülleri depolimerleşdirip bilse-de, disopiramid kökleriň güýçli bozulmasyna sebäp bolýar, orizalin bolsa deňeşdirme boýunça ýeňil täsir edýär. Mundan başga-da, mikrotübülleri durnuklaşdyrýan tubulindäki mutasiýalar köklerde dekstrorotasiýa hem sebäp bolýar, mikrotübülleriň dinamikasyny hem durnuklaşdyrýan paklitaksel bolsa sebäp bolmaýar. Şonuň üçin ursolik kislotanyň molekulýar nyşanalaryny öwrenmek we kesgitlemek ösümlik kortikal mikrotubulalarynyň düzgünleşdirilmegine täze düşünjeler bermelidir. Şeýle hem, disopiramid ýaly bozulan ösüşi höweslendirmekde netijeli bolan himiki maddalaryň we oryzalin ýa-da kumamotor kislotasy ýaly has az netijeli himiki maddalaryň geljekde deňeşdirilmegi bozulan ösüşiň nähili bolýandygynyň alamatlaryny berer.
Beýleki tarapdan, goranyş bilen baglanyşykly sitoskelet üýtgeşmeleri urson turşusynyň sitotoksikligini düşündirmegiň başga bir mümkinçiligidir. Patogeniň ýokuşmagy ýa-da ösümlik öýjüklerine eksitoryň girizilmegi käwagt sitoskeletiň ýok edilmegine we soňraky öýjük ölümine sebäp bolýar29. Mysal üçin, oomisetden alynýan kriptoksantiniň KAND bejergisinde bolýan ýaly, temmäki öýjükleriniň ölüminden öň mikrotubulalary we aktin filamentlerini bozýandygy habar berildi30,31. Goranyş jogaplary bilen urson turşusy tarapyndan döredilen öýjük jogaplarynyň arasyndaky meňzeşlikler, olaryň umumy öýjük proseslerini başlatýandygyny çaklamaga getirdi, emma urson turşusynyň kriptoksantinden has çalt we güýçli täsiri aýdyň görünýär. Şeýle-de bolsa, barlaglar aktin filamentleriniň bozulmagynyň öýjükleriň öz-özünden ölümine sebäp bolýandygyny görkezdi, bu bolsa hemişe mikrotubulalaryň bozulmagy bilen utgaşmaýar29. Mundan başga-da, urson turşusynyň töremeleri ýaly, patogeniň ýa-da eksitoryň kökleriň bozulmagyna sebäp bolup-bolmaýandygyny anyklamak gerek. Şeýlelik bilen, goranyş jogaplaryny we sitoskeletini baglanyşdyrýan molekulýar bilim çözülmeli özüne çekiji meseledir. Urson turşusy bilen baglanyşykly pes molekulýar agramly birleşmeleriň, şeýle hem dürli kuwwatlylyklara eýe bolan dürli türewleriň bardygyny ulanmak arkaly olar näbelli öýjük mehanizmlerini nyşana almak üçin mümkinçilikleri döredip bilerler.
Mikrotubulalaryň dinamikasyny üýtgedýän täze birleşmeleriň açylmagy we ulanylmagy ösümlik öýjükleriniň görnüşini kesgitlemegiň esasynda duran çylşyrymly molekulýar mehanizmleri çözmek üçin güýçli usullary üpjün eder. Şu kontekstde, mikrotubulalara we aktin filamentlerine täsir edýän we öýjükleriň ölümine sebäp bolýan ýakynda işlenip düzülen urmoton turşusy birleşmesi mikrotubulalaryň gözegçiligi bilen şu beýleki mehanizmleriň arasyndaky baglanyşygy çözmäge mümkinçilik döredip biler. Şeýlelik bilen, urbenon turşusyny ulanyp himiki we biologiki seljerme bize ösümlik sitoskeletini dolandyrýan molekulýar düzgünleşdiriji mehanizmleri düşünmäge kömek eder.
S. werraensis MK493-CF1-i 2% (w/v) galaktoza, 2% (w/v) Essence pastasy, 1% (w/v) Bacto düzümi bolan 110 ml tohumlyk gurşaw saklaýan 500 ml Erlenmeyer kolbasyna ekiň. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) mekgejöwen ekstrakty (KOGOSTCH Co., Ltd., Ýaponiýa), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 we 0.2% CaCO3 deionlaşdyrylan suwda (sterilizasiýadan öň pH 7.4). Tohum medeniýetleri aýlanýan silkdirijide (180 aý/min) 27°C-da 2 günläp inkubasiýa edildi. Öndüriş gaty ýagdaýda fermentasiýa arkaly ösdürilip ýetişdirildi. Tohum medeniýeti (7 ml) 15 g preslenen arpadan (MUSO Co., Ltd., Ýaponiýa) we 25 g deionlaşdyrylan suwdan (sterilizasiýadan öň pH düzedilmedik) ybarat bolan 40 g önümçilik gurşawy bolan 500 ml K-1 kolbasyna geçirildi. Fermentasiýa 14 günläp garaňky ýerde 30°C-da geçirildi. Fermentasiýa materialy 40 ml/çüýşe EtOH bilen ekstraksiýa edildi we santrifuga edildi (1500 g, 4°C, 10 minut). Medeniýetiň üstki gatlagy (60 ml) 10% MeOH/EtOAc garyndysy bilen ekstraksiýa edildi. Organiki gatlak pes basyş astynda buglanyp, galyndy (59,5 mg) alyndy, ol bolsa ters fazaly sütünçede (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × uzynlyk 250 mm) gradientli elusiýa bilen HPLC-e sezewar edildi (0–10 minut: 90%) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90% H2O/CH3CN-den 70% H2O/CH3CN-e (gradient), 35–45 minut: 90% H2O/EtOH, 45–155 minut: 90% H2O/EtOH-dan 100% EtOH-a (gradient (gradient), 155–200 minut: 100% EtOH) 1,5 ml/min akym tizliginde, kumamonamid (1,36,0 mg) ak amorf poroşok hökmünde bölünip alyndy.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hasaplanan gymmat: 141.0659, ölçenen gymmat: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 sm–1.
Kolumbiýa tohumlary (Col-0) ylmy-barlag işleri üçin rugsat bilen Arabidopsis Biologiki Serişdeler Merkezinden (ABRC) alyndy. Col-0 tohumlary biziň laboratoriýa şertlerimizde köpeldildi we saklandy, şeýle hem ýabany görnüşli Arabidopsis ösümlikleri hökmünde ulanyldy. Arabidopsis tohumlary ýüzleý sterilizasiýa edildi we 2% saharoza (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfon turşusy (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) we 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical) bolan ýarym berk Murashige we Skoog gurşawynda, pH 5,7-de, 23 °C temperaturada we hemişelik ýagtylykda ösdürilip ýetişdirildi. phs1-1 mutantynyň tohumlary T. Haşimoto (Nara Ylym we Tehnologiýa Instituty) tarapyndan üpjün edildi.
SR-1 ştammynyň tohumlary T. Haşimoto (Nara Ylym we Tehnologiýa Instituty) tarapyndan üpjün edildi we ýabany görnüşli temmäki ösümlikleri hökmünde ulanyldy. Temmäki tohumlary ýüzden sterilizasiýa edildi we çişmegini höweslendirmek üçin üç gije steril suwda çümdürildi, soňra pH 5.7 bolan 2% saharoza, 0.05% (w/v) MES we 0.8% gellan sakyzy (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige we Skoog ortamy) bolan ýarym güýçli ergine goýuldy we 23°C-de yzygiderli ýagtylygyň aşagynda inkubasiýa edildi.
Tak-1 ştammy T. Kohçi (Kioto uniwersiteti) tarapyndan hödürlendi we bagyr ösümligini öwrenmek üçin standart tejribe birligi hökmünde ulanyldy. Gemma sterilizirlenen ösdürilip ýetişdirilen ösümliklerden alyndy we soňra 1% saharoza we 0,3% gellan sakyzy bolan Gamborg B5 ortamyna (Fujifilm Wako Pure Chemical) goşuldy we 23°C-de üznüksiz ýagtylygyň aşagynda inkubasiýa edildi.
Temmäki BY-2 öýjükleri (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokio uniwersiteti) tarapyndan üpjün edildi. BY-2 öýjükleri üýtgedilen Linsmeier we Skoog gurşawynda 95 esse suwlandyryldy we hepdede 2,4-dihlorfenoksiaset turşusy bilen goşuldy 32 . Öýjük suspenziýasy garaňkyda 27°C-de 130 aýlaw/minut tizlikde aýlanýan silkdirijide garyşdyryldy. Öýjükleri täze gurşawyň göwrüminden 10 esse köp bolan önüm bilen ýuwuň we şol bir gurşawda gaýtadan suspenziýa ediň. Gül kelem mozaika wirusy 35S promotorynyň aşagynda mikrotubula markerini TagRFP-TUA6 ýa-da aktin filament markerini GFP-ABD2 durnukly beýan edýän BY-2 transgen öýjük liniýalary beýan edilişi ýaly döredildi 33, 34, 35. Bu öýjük liniýalary asyl BY-2 öýjük liniýasy üçin ulanylýanlara meňzeş amallar arkaly saklanyp we sinhronlaşdyrylyp bilner.
HeLa öýjükleri 37°C temperaturadaky inkubatorda 5% CO2 bilen 10% fetal sygyr syworoty, 1.2 U/ml penisillin we 1.2 μg/ml streptomisin goşulan Dulbecco-nyň üýtgedilen Eagle's gurşawynda (DMEM) (Life Technologies) ösdürilip ýetişdirildi.
Bu golýazmada beýan edilen ähli tejribeler Ýaponiýanyň biohowpsuzlyk düzgünlerine we görkezmelerine laýyklykda geçirildi.
Birleşmeler dimetil sulfoksidde (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ştamp erginleri hökmünde eredildi we Arabidopsis we temmäki üçin MS gurşawynda ýa-da bagyr otlary üçin Gamborg B5 gurşawynda eredildi. Kökleriň ösüşiniň öňüni alyş synagy üçin, görkezilen birleşmeleri ýa-da DMSO saklaýan agar gurşawynda her tarelkada 10-dan gowrak tohum ekildi. Tohumlar ösüş kamerasynda 7 gün inkubasiýa edildi. Şitilleriň suraty alyndy we kökleriň uzynlygy ölçeldi. Arabidopsis çişme synagy üçin, her tarelkada 48 tohum 200 μM birleşme ýa-da DMSO saklaýan agar gurşawynda ekildi. Arabidopsis tohumlary ösüş kamerasynda ösdürilip ýetişdirildi we çişmeden 7 gün soň (dag) çişmeden soň çişmeleriň sany hasaplandy. Temmäki çişme synagy üçin, her tarelkada 24 tohum 200 μM KAND ýa-da DMSO saklaýan agar gurşawynda ekildi. Temmäki tohumlary ösüş kamerasynda ösdürilip ýetişdirildi we çişmeden soň çişmeleriň sany 14 günden soň hasaplandy. Bagyr ösümliginiň ösüşiniň öňüni alyş synagy üçin her bir plastinkadan 9 embrion görkezilen konsentrasiýalary KAND ýa-da DMSO bolan agar gurşawynda ýerleşdirilip, ösüş kamerasynda 14 günläp inkubasiýa edildi.
Kök meristemasynyň gurluşyny göz öňüne getirmek üçin 5 mg/ml propidium ýodidi (PI) bilen boýalan nahallary ulanyň. PI signallary TCS SPE konfokal lazer skanerleme mikroskopy (Leica Microsystems) ulanylyp, fluoresensiýa mikroskopiýasy arkaly syn edildi.
Kökleriň β-glýukuronidaza (GUS) bilen gistohimiki boýalmagy Malami we Benfey36 tarapyndan beýan edilen protokola laýyklykda geçirildi. Şitiller bir gije 90% asetonda berkidildi, 1 sagatlap GUS buferinde 0,5 mg/ml 5-bromo-4-hlor-3-indolil-β-d-glýukuron turşusy bilen boýaldy we gidratlanan hloraldegid erginine (8 g hloral gidrat, 2 ml suw we 1 ml gliserin) goýuldy we Axio Imager M1 mikroskopy (Carl Zeiss) ulanyp differensial interferensiýa kontrast mikroskopiýasy arkaly syn edildi.
Kök burçlary dik ýerleşdirilen tarelkalarda ösdürilip ýetişdirilen 7 günlük nahallarda ölçeldi. 6-njy ädimde beýan edilişi ýaly, kök burçuny agyrlyk wektorunyň ugrundan ölçeň.
Kortikal mikrotubulalaryň ýerleşişi beýan edilişi ýaly syn edildi, protokola 37 kiçi üýtgetmeler girizildi. Anti-β-tubulin antitela (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) we Alexa Fluor 488 bilen birleşdirilen syçan garşy IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) degişlilikde 1:1000 we 1:100 suwuklandyrmalarda esasy we ikinji derejeli antitela hökmünde ulanyldy. Fluoresensiýa suratlary TCS SPE konfokal lazer skanerleme mikroskopy (Leica Microsystems) arkaly alyndy. Z-stek suratlaryny alyň we öndürijiň görkezmelerine laýyklykda iň ýokary intensiwlikli proýeksiýalary dörediň.
HeLa öýjükleriniň köpeliş synagy öndürijiň görkezmelerine laýyklykda Öýjük Sanaýjy Kit 8 (Dojindo) ulanylyp geçirildi.
E. coli DH5α-nyň ösüşi 600 nm-de (OD600) spektrofotometr ulanyp, medeniýetde öýjük dykyzlygyny ölçemek arkaly seljerildi.
Transgen BY-2 öýjüklerinde sitoskeletin gurluşy CSU-X1 konfokal skanirleme enjamy (Yokogawa) we sCMOS kamerasy (Zyla, Andor Technology) bilen enjamlaşdyrylan fluoresensiýa mikroskopy arkaly syn edildi. Sitoskeletin dykyzlygy surat seljermesi arkaly bahalandyryldy, bu bolsa ImageJ programma üpjünçiligini ulanyp konfokal suratlardaky sitoplazmatik pikselleriň arasyndaky sitoskeletin pikselleriniň göterimini kesgitledi38,39.
BY-2 öýjüklerinde öýjük ölümini anyklamak üçin, öýjük suspenziýasynyň bir bölegi otag temperaturasynda 10 minutlap 0,05% Evans gök reňki bilen inkubasiýa edildi. Öli öýjükleriň Evans gök reňkini saýlama boýamagy, boýagyň diri öýjüklerden bitewi plazma membranasy tarapyndan çykarylmagyna baglydyr40. Boýalan öýjükler ýagty meýdanly mikroskop (BX53, Olympus) arkaly syn edildi.
HeLa öýjükleri 37°C we 5% CO2-de çygly inkubatorda 10% FBS goşulan DMEM-de ösdürilip ýetişdirildi. Öýjükler 37°C-de 6 sagatlap 100 μM KAND 11, kumamonam turşusy 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) ýa-da 100 ng/ml Nokodmaze (Sigma) bilen işlenildi. Öýjükler otagyň temperaturasynda 10 minutlap MetOH bilen, soňra bolsa 5 minutlap asetat bilen fiksasiýa edildi. Fiksirlenen öýjükler 2 sagatlap 0,5% BSA/PBS-de eredilen β-tubulin esasy antitela (1D4A4, Proteintech: 66240-1) bilen inkubasiýa edildi, 3 gezek TBST bilen ýuwuldy we soňra Alexa Fluor geçi antitela bilen inkubasiýa edildi. 488 1 sagat. – Syçan IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) we 0.5% BSA/PBS-de eredilen 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). TBST bilen üç gezek ýuwulandan soň, boýalan öýjükler Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskopynda syn edildi. Suratlar MetaMorph programma üpjünçiligini (Molecular Devices) ulanyp, sowadylan Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerasy bilen düşürildi.
Ýerleşdirilen wagty: 2024-nji ýylyň 17-nji iýuny